1.2方法
1.2.1菌种活化
取-80℃保存的水稻黄单胞菌，使用接种环蘸取菌液在NA平板上划线，在30℃恒温培养箱中倒置培养2~3 d，随后挑取单菌落接种于5 mL NB培养基中，30℃、180 r min-1培养24 h。
1.2.2噬菌体分离与纯化
将水样在5000×g下离心10 min，使用抽滤泵和0.45μm滤膜对上清液进行过滤，在滤液中添加MgSO4至终浓度为50 mmol L-1，静置10 min后使用0.22μm滤膜抽滤。收集0.22μm滤膜放入100 mL洗脱液(3%吐温80，3%牛肉膏，5 mmol L-1 NaCl)中，超声20 min后过滤除菌，所得滤液即为噬菌体原液。
吸取100µL水稻黄单胞菌与100µL上述噬菌体原液加入到5 mL NB培养基中，30℃、180 r min-1培养24 h，过滤除菌后得到扩培液。重复此扩培过程3次。取100µL菌液加入5 mL NB(0.4%琼脂，2 mmol L-1 CaCl2)培养基中，倒入NA固体平板中，待其凝固后，使用扩培液点样，置于30℃恒温培养箱24 h，观察有无噬菌斑形成。使用双层板法纯化噬菌体，挑选单个噬菌斑到5 mL NB培养基中过夜培养，离心，取上清液过滤，滤液适当稀释后重复上述操作6~7轮，直至得到大小和形态一致的噬菌斑。得到的噬菌体纯化液可置于4℃备用，并加入终浓度为30%的甘油于-80℃保藏。
1.2.3形态观察
采用CsCl密度梯度离心法纯化噬菌体浓缩液，依次将2.5 mL 1.3 g mL-1、2.5 mL 1.5 g mL-1、2.5 mL 1.7 g mL-1浓度的CsCl及噬菌体浓缩液加入到10 mL贝克曼离心管中。使用SW 41 Ti转子(Optima XPN-100 ultracentrifuge，Beckman Coulter，美国)，200，600×g、4℃离心3 h，在1.3 g mL-1和1.5 g mL-1 CsCl之间形成蓝白色条带，用注射器收集此处的噬菌体颗粒，经磷钨酸(2%)染色法染色后使用透射电镜(TEM，Hitachi H-7650)观察噬菌体形态。
1.2.4噬菌体效价的测定
使用SM buffer对噬菌体扩培液进行10倍倍比梯度稀释，分别取最后的3个稀释梯度各100μL噬菌体与100μL宿主菌混匀后加入到5 mL培养基(0.4%琼脂，2 mmol L-1 CaCl2)中，混匀后倾倒在固体平板上，待琼脂凝固后转移至培养箱倒置培养一段时间后对平板上的噬菌斑进行计数，每个处理重复3次。噬菌体效价(Phage titer，pfu mL-1)=平均噬菌斑个数×噬菌体稀释倍数×10。
1.2.5宿主谱测定
通过双层平板点样法鉴定宿主谱。将噬菌体效价分别稀释为1×1010~1×106 pfu mL-1 5个梯度。将100μL菌液加入到含0.4%琼脂的5 mL NB培养基中，混匀倒于NA平板上，吸取5个梯度的2μL噬菌体培养液分别滴至平板，将平板倒置于30℃恒温培养箱中培养24 h后观察有无噬菌斑出现。
1.2.6噬菌体测序及基因组分析
使用苯酚—氯仿法提取噬菌体DNA。通过Illumina Miseq测序平台对提取的噬菌体DNA进行测序，通过SPAdes v.3.12.2拼接组装，获得噬菌体的全基因组序列。将噬菌体的全基因组序列在NCBI数据库中的BLASTn进行比对，使用ANIm进行核苷酸序列相似性计算。通过Prokka对噬菌体基因组信息进行注释。利用在线网站对基因组进行可视化分析。分别利用耐药性基因数据库、毒力因子数据库、tRNA Scan-SE在线网站分析噬菌体是否含有耐药基因、毒力基因及tRNA基因。
1.2.7蛋白网络图分析和系统发育树构建
为进一步确定噬菌体的亲缘关系，对其进行蛋白网络图分析和系统发育树构建。采用vConTACT 2.0、Cytoscape 3.7.2绘制噬菌体蛋白网络图。系统发育树选取保守性较强的末端酶大亚基蛋白(TerL)基因作为标志基因，用FastTree构建系统发育树。
1.2.8最佳感染复数测定
噬菌体感染复数(multiplicity of infection，MOI)是指噬菌体与宿主菌数量的比值。参考前人的文献并进行了一些修改，将噬菌体稀释成1×1010~1×104 pfu mL-1，将宿主菌用SM buffer调整至1×108 cfu mL-1。根据不同MOI(100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001)分别取100μL对应效价的噬菌体液和100μL宿主菌加入5 mL NB(2 mmol L-1 CaCl2)中，30℃、180 r min-1共培养24 h，离心去除细菌沉淀，取上清使用双层平板法测定效价。试验重复3次，测得效价最高的MOI为最佳MOI。
1.2.9一步生长曲线测定
一步生长曲线反映了噬菌体复制过程中数量的动态变化，是衡量噬菌体裂解能力的一个重要指标。按照MOI=0.1分别取100μL 1×107 pfu mL-1噬菌体和100μL 1×108 cfu mL-1宿主菌与800μL SM Buffer(含2 mmol L-1 CaCl2)混匀，30℃静置30 min后8000×g离心2 min，使用0.45μm滤头过滤，取上清液计算未吸附的噬菌体数量。同时用1 mL SM Buffer重悬沉淀，取100μL重悬液加入9.9 mL NB(含2 mmol L-1 CaCl2)培养基中混匀，取适量混合液过滤，记为1 h，测定噬菌体效价。将剩余混合液在30℃、180 r min-1条件下培养，每隔1 h取一次样，直至12 h。将滤液进行适当稀释，通过双层平板法测定不同时间点的噬菌体效价。噬菌体爆发量(pfu cell-1)=噬菌体爆发量平稳期平均爆发量/吸附进入宿主菌的噬菌体数。
1.2.10噬菌体耐受性测定
研究噬菌体的耐受性主要是测定噬菌体对温度、pH和紫外线的耐受性。温度耐受性试验参考Zhang等的方法，把噬菌体效价调整为1×108 pfu mL-1，取1 mL噬菌体液放置于不同的温度(4、20、30、37、40、50、60、70、80℃)下水浴1 h，测定噬菌体的效价。噬菌体pH耐受性试验参考Kumar等的研究，利用1 mol L-1的氢氧化钠和盐酸将NB液体培养基调成不同的pH(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)。将100μL噬菌体(1×109 pfu mL-1)分别加入到900μL不同pH的NB溶液中，37℃温浴1 h，测定噬菌体的效价。对于紫外耐受的测定，根据前人做一定修改，将10 mL噬菌体(1×108 pfu mL-1)加入无菌培养皿中。并在生物安全柜内将培养皿放于紫外灯(254 nm，25 W)下方15 cm，照射30 min，每隔5 min取一次样，最后测定所有样品效价。以上试验全部重复3次。
1.2.11噬菌体抑制黄单胞菌试验
通过监测细菌OD600的变化，评估噬菌体对黄单胞宿主菌Xoo 2068的抑制作用。将噬菌体效价稀释为1×1010~1×104 pfu mL-1，将宿主菌稀释为1×108 cfu mL-1。根据不同MOI(100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001)分别取100µL噬菌体和宿主菌加入96孔板中混合均匀，对照组用SM buffer代替噬菌体。将96孔板放入预热好的30°C酶标仪中，测定OD600的值，记为0 min。每6 h测量一次，持续48 h，试验重复3次。
1.2.12数据分析
采用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验进行数据分析，P<0.05表示有显著性差异。利用软件GraphPad Prism 8.0绘图。
相关新闻推荐
1、微生物生长曲线分析仪首次记录蜡样芽孢杆菌在太空飞行期间各种变化
2、牛皮肤结节病毒分离鉴定、生长曲线、免疫荧光、TCID50测定（三）