2结果
2.1病原的分离纯化
患病牛肺脏处理液接种PPLO液体培养基，传代培养至第2代可见培养基由红变黄并保持澄清。将第3代培养物涂布于PPLO固体培养基，3~5天后可见表面光滑、针尖大小的白色小菌落生长（图1A）。在40-100X显微镜下观察，菌落呈典型的边缘整齐的“煎蛋样”形态（图1B）。经过3轮液体-固体克隆纯化后获得纯培养物，命名为YJ-22。
图1 YJ-22分离株菌落形态
(A)固体培养基上的菌落（肉眼观）；(B)显微镜下的菌落形态（40-100X，“煎蛋样”）。
2.2 PCR及测序鉴定结果
使用特异性引物MB-P48-F/MB-P48-R扩增纯化的YJ-22菌株DNA，在约526 bp处获得单一的、与阳性对照一致的清晰条带，阴性对照无条带（图2）。测序结果显示该片段为M.bovis P48基因的部分序列。GenBank BLAST比对分析表明，该序列与参考菌株M.bovis MJ-1(CP042938.1)、M.bovis DADC51(CP040775.1)、M.bovis VK30(CP058467.1)等相应区域序列的相似性均高于99.3%，确认为牛支原体。
图2 YJ-22分离株P48基因PCR扩增结果
M：DL2000 DNA分子量标准；1：YJ-22分离株；2：阴性对照（ddH₂O）；3：阳性对照（M.bovis标准株DNA）。
2.3生化鉴定结果
YJ-22分离株的生化反应结果见表1。结果显示，该菌株不能发酵葡萄糖或甘露醇，不能水解精氨酸或明胶，不分解尿素，但能利用乳糖。这些生化特征完全符合牛支原体的典型特性。
表1 YJ-22分离株生化鉴定结果
2.4生长曲线绘制
根据间隔取样测定的CCU LOG值，绘制了YJ-22分离株在PPLO液体培养基中的生长曲线（图3）。结果显示，该菌株接种后经历短暂迟缓期（约9小时），随后进入快速对数生长期（9-18小时）。在18至45小时间，活菌数维持在一个较高的平台期（1×10⁸~1×10⁹CCU/mL）。45小时后进入衰亡期，活菌数逐渐下降，至60小时降至约1×10⁶CCU/mL。
图3 YJ-22分离株在PPLO液体培养基中的生长曲线
2.5 YJ-22分离株致病性研究结果
2.5.1临床症状
攻毒组（2头犊牛）在攻毒后第9天均开始出现明显的临床症状：咳嗽（尤其驱赶时）、喘气、呼吸频率加快、两侧鼻孔有浆液性/粘液性分泌物增多。在攻毒后第3天，两头攻毒牛体温均开始升高（比攻毒前基础体温升高约0.7~1.0℃），高体温状态持续约3天后逐渐恢复至正常水平（图4）。对照组（2头犊牛）在整个观察期内精神、食欲、呼吸均正常，体温保持平稳（图4），未见咳嗽、流涕等任何异常。攻毒组牛未见明显的关节炎症状。
图4攻毒试验中犊牛的体温变化曲线
(攻毒组数据点为平均值，攻毒时间为第0,1,2天)。
2.5.2排菌情况
对试验期间采集的所有鼻拭子样品进行M.bovis分离培养和PCR检测。攻毒前所有试验牛的鼻拭子均为阴性。攻毒后，对照组鼻拭子始终阴性。攻毒组两头牛在攻毒后第1天（即首次攻毒后）即可检出病原，在随后监测的22天内多次检测为阳性（分离鉴定和PCR结果一致），显示持续性排菌。具体检测阳性率（阳性采样点数/总采样点数）：攻毒1号牛为40%（4/10），攻毒2号牛为50%（5/10）（表2）。
2.5.3剖检病变
攻毒后第21天剖检所有试验牛。对照组两头牛的肺脏肉眼观察均正常，色泽粉红，质地柔软有弹性，未见明显的实变、出血或脓肿，偶见个别点状出血或轻微粘连（属于背景病变）。参考Maunsell等标准进行病变评分：对照组1号牛得1分，2号牛得2分，表明肺部无明显M.bovis相关损伤。
攻毒组两头牛的肺脏均呈现严重的广泛性病变（图5A,B）。肺脏表现为大面积的肉变（肺实变）、肝变（质地如肝）、明显的充血和出血灶，病变区域与健康区域界限清晰。这些病变主要分布在肺的尖叶、心叶和膈叶前缘。攻毒1号牛病变评分9分，攻毒2号牛病变评分11分。其他脏器未见M.bovis相关的特异性病变。
图5攻毒试验犊牛肺脏剖检病变
(A)攻毒1号牛肺：广泛性肉变、肝变及出血；(B)攻毒2号牛肺：严重的肉变、肝变及出血灶；(C)对照1号牛肺：正常；(D)对照2号牛肺：正常（偶见点状出血）。
2.5.4病理组织学观察
对照组牛的肺脏组织学结构正常：肺泡大小均匀，间隔清晰，无明显炎症细胞浸润，细支气管上皮完整（图6C,D）。
攻毒组牛的肺组织显示出严重的病理改变（图6A,B）：肺泡结构广泛破坏，大量肺泡腔实变、塌陷；肺间质增厚，血管扩张充血；可见明显的局灶性或片状出血区域；肺泡腔内、细支气管腔内及肺间质内可见大量以单核细胞（淋巴细胞、巨噬细胞）为主的炎性细胞浸润，并伴有不同程度的嗜中性粒细胞浸润；部分区域可见纤维结缔组织增生（早期纤维化改变）。这些病理变化特征符合牛支原体肺炎的慢性支气管间质性肺炎表现。
图6攻毒试验犊牛肺脏组织病理学变化(H&E染色)
(A)攻毒1号牛：肺结构破坏，实变区炎症细胞浸润（箭头），间质增宽；(B)攻毒2号牛：肺泡腔融合实变（），间质及肺泡腔大量炎性细胞浸润（箭头），出血（#）；(C)对照1号牛：肺泡结构正常；(D)对照2号牛：肺泡结构正常。(标尺：100μm).
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