2结果
2.1病原的分离纯化
患病牛肺脏处理液接种PPLO液体培养基,传代培养至第2代可见培养基由红变黄并保持澄清。将第3代培养物涂布于PPLO固体培养基,3~5天后可见表面光滑、针尖大小的白色小菌落生长(图1A)。在40-100X显微镜下观察,菌落呈典型的边缘整齐的“煎蛋样”形态(图1B)。经过3轮液体-固体克隆纯化后获得纯培养物,命名为YJ-22。
图1 YJ-22分离株菌落形态
(A)固体培养基上的菌落(肉眼观);(B)显微镜下的菌落形态(40-100X,“煎蛋样”)。
2.2 PCR及测序鉴定结果
使用特异性引物MB-P48-F/MB-P48-R扩增纯化的YJ-22菌株DNA,在约526 bp处获得单一的、与阳性对照一致的清晰条带,阴性对照无条带(图2)。测序结果显示该片段为M.bovis P48基因的部分序列。GenBank BLAST比对分析表明,该序列与参考菌株M.bovis MJ-1(CP042938.1)、M.bovis DADC51(CP040775.1)、M.bovis VK30(CP058467.1)等相应区域序列的相似性均高于99.3%,确认为牛支原体。
图2 YJ-22分离株P48基因PCR扩增结果
M:DL2000 DNA分子量标准;1:YJ-22分离株;2:阴性对照(ddH₂O);3:阳性对照(M.bovis标准株DNA)。
2.3生化鉴定结果
YJ-22分离株的生化反应结果见表1。结果显示,该菌株不能发酵葡萄糖或甘露醇,不能水解精氨酸或明胶,不分解尿素,但能利用乳糖。这些生化特征完全符合牛支原体的典型特性。
表1 YJ-22分离株生化鉴定结果
2.4生长曲线绘制
根据间隔取样测定的CCU LOG值,绘制了YJ-22分离株在PPLO液体培养基中的生长曲线(图3)。结果显示,该菌株接种后经历短暂迟缓期(约9小时),随后进入快速对数生长期(9-18小时)。在18至45小时间,活菌数维持在一个较高的平台期(1×10⁸~1×10⁹CCU/mL)。45小时后进入衰亡期,活菌数逐渐下降,至60小时降至约1×10⁶CCU/mL。
图3 YJ-22分离株在PPLO液体培养基中的生长曲线
2.5 YJ-22分离株致病性研究结果
2.5.1临床症状
攻毒组(2头犊牛)在攻毒后第9天均开始出现明显的临床症状:咳嗽(尤其驱赶时)、喘气、呼吸频率加快、两侧鼻孔有浆液性/粘液性分泌物增多。在攻毒后第3天,两头攻毒牛体温均开始升高(比攻毒前基础体温升高约0.7~1.0℃),高体温状态持续约3天后逐渐恢复至正常水平(图4)。对照组(2头犊牛)在整个观察期内精神、食欲、呼吸均正常,体温保持平稳(图4),未见咳嗽、流涕等任何异常。攻毒组牛未见明显的关节炎症状。
图4攻毒试验中犊牛的体温变化曲线
(攻毒组数据点为平均值,攻毒时间为第0,1,2天)。
2.5.2排菌情况
对试验期间采集的所有鼻拭子样品进行M.bovis分离培养和PCR检测。攻毒前所有试验牛的鼻拭子均为阴性。攻毒后,对照组鼻拭子始终阴性。攻毒组两头牛在攻毒后第1天(即首次攻毒后)即可检出病原,在随后监测的22天内多次检测为阳性(分离鉴定和PCR结果一致),显示持续性排菌。具体检测阳性率(阳性采样点数/总采样点数):攻毒1号牛为40%(4/10),攻毒2号牛为50%(5/10)(表2)。
2.5.3剖检病变
攻毒后第21天剖检所有试验牛。对照组两头牛的肺脏肉眼观察均正常,色泽粉红,质地柔软有弹性,未见明显的实变、出血或脓肿,偶见个别点状出血或轻微粘连(属于背景病变)。参考Maunsell等标准进行病变评分:对照组1号牛得1分,2号牛得2分,表明肺部无明显M.bovis相关损伤。
攻毒组两头牛的肺脏均呈现严重的广泛性病变(图5A,B)。肺脏表现为大面积的肉变(肺实变)、肝变(质地如肝)、明显的充血和出血灶,病变区域与健康区域界限清晰。这些病变主要分布在肺的尖叶、心叶和膈叶前缘。攻毒1号牛病变评分9分,攻毒2号牛病变评分11分。其他脏器未见M.bovis相关的特异性病变。
图5攻毒试验犊牛肺脏剖检病变
(A)攻毒1号牛肺:广泛性肉变、肝变及出血;(B)攻毒2号牛肺:严重的肉变、肝变及出血灶;(C)对照1号牛肺:正常;(D)对照2号牛肺:正常(偶见点状出血)。
2.5.4病理组织学观察
对照组牛的肺脏组织学结构正常:肺泡大小均匀,间隔清晰,无明显炎症细胞浸润,细支气管上皮完整(图6C,D)。
攻毒组牛的肺组织显示出严重的病理改变(图6A,B):肺泡结构广泛破坏,大量肺泡腔实变、塌陷;肺间质增厚,血管扩张充血;可见明显的局灶性或片状出血区域;肺泡腔内、细支气管腔内及肺间质内可见大量以单核细胞(淋巴细胞、巨噬细胞)为主的炎性细胞浸润,并伴有不同程度的嗜中性粒细胞浸润;部分区域可见纤维结缔组织增生(早期纤维化改变)。这些病理变化特征符合牛支原体肺炎的慢性支气管间质性肺炎表现。
图6攻毒试验犊牛肺脏组织病理学变化(H&E染色)
(A)攻毒1号牛:肺结构破坏,实变区炎症细胞浸润(箭头),间质增宽;(B)攻毒2号牛:肺泡腔融合实变(),间质及肺泡腔大量炎性细胞浸润(箭头),出血(#);(C)对照1号牛:肺泡结构正常;(D)对照2号牛:肺泡结构正常。(标尺:100μm).
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