上呼吸道感染（upper respiratory tract disease，URTD）是猫常见的临床疾病，是引起幼猫死亡的重要原因之一，通常由一种或多种病原感染引起，从而出现以呼吸道或眼部疾病为特征的猫呼吸道疾病症候群。引起URTD的病原很多，但主要为猫杯状病毒（feline calicivirus，FCV）、猫疱疹病毒1型（feline herpesvirus type 1，FHV-1）和猫流感病毒（feline influenza virus，FIV）。
FCV在猫群中的感染率很高，常引起猫口腔溃疡和上呼吸道症状，也可引起其他疾病，如跛行、流产、慢性胃肠炎、尿道感染等。该病毒既可单独感染，也可与其他病原混合感染，严重危害猫及猫科动物的健康。FHV-1是一种高度接触性传染病原，也可垂直传播，引起的发病率很高，可达100%，但成年猫感染后病死率很低，幼猫感染后症状严重，病死率可达50%，未死亡的猫可终生带毒排毒，危害很大。猫及猫科动物都对FIV十分易感，通过食入感染的动物性食品或接触感染的人和动物都很容易被感染。目前在猫及猫科动物身上已分离到多种亚型FIV，包括H1N1、H5N1、H5N6及H7N2等。秋冬为猫呼吸道疾病高发季节，为此本研究对患有上呼吸道症状疾病的临床猫病例进行FCV、FHV-1和FIV的分离与鉴定，了解在该季节上海市猫上呼吸道疾病病例中FCV、FHV-1和FIV的感染比例，为猫上呼吸道疾病的防控和治疗提供依据。
1材料和方法
1.1样品及来源
2020年11月至2021年3月，以上海市中心城区宠物医院接诊的以及来自猫舍的具有上呼吸道感染症状的猫为研究对象，采集每只患病猫的眼结膜、口咽和鼻黏膜拭子53份，其中宠物医院30份、猫舍23份，每个病例样品一式两份。样品采集好后立即送至上海兽医疾病诊断中心实验室进行病毒分离与鉴定。
1.2主要试剂
F81细胞（猫肾传代细胞），由上海兽医疾病诊断中心实验室保存；SPF鸡胚（批号11401000020754），购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司；DMEM细胞培养液（批号2126865）、0.25%的胰酶消化液（批号2042303），均购自GIBCO公司；胎牛血清（批号2418），购自SIGMA公司；核酸提取试剂盒（批号MDII14-01），购自Magen公司；PrimeScriptTMRT-PCR Kit（批号AJ62323A）、LA PCR™Kit Ver.2.1（批号AK5301）、Prime Script™One Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）（批号AKE0559A），均购自宝生物工程（大连）公司。
1.3病原分离、鉴定及同源性分析
1.3.1 FCV F81细胞常规消化传代，待长成单层且贴壁率达到90%时，将细胞按照1:3的比例消化传代，同时将待测样品经过0.22µm滤膜过滤后同步接种到细胞中，放入37℃，5%CO2培养箱中培养，每12 h观察细胞病变（CPE）1次；待70%细胞出现CPE时，将培养液冻融3次，2 000 r/min离心5 min，收获细胞上清；96 h后将未出现CPE的细胞上清收获，盲传3代，收获第3代细胞上清提取病毒RNA。根据文献合成FCVVP1基因检测引物（上游：ATGTGCTCAACCTGCGC；下游：TCATAATTTAGTCATTGAGCTCCT），扩增片段大小为2 007～2 010 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit说明书进行PCR扩增后取5μL RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性RT-PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。应用MEGA 6.0软件和DNAstar v7.1软件，对FCVVP1基因序列进行遗传进化分析，比较其与GenBank中参考序列核苷酸同源性差异，绘制基因进化树。
1.3.2 FHV-1按照1.3.1中的病毒分离步骤进行病毒分离，将收获的第3代细胞上清提取病毒DNA。根据FHV-1gB基因保守序列（S49775.1）合成基因检测引物（上游：GGGGTGGGTGGACGGTGAGTAA；下游：TAGGTCTCCAGGGTTCCAGTCT）。扩增片段大小为1 798 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit说明书进行PCR扩增后取5μL PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。应用MEGA 6.0软件和DNAstar v7.1软件，对FHV-1gB基因序列进行遗传进化分析，比较其与GenBank中参考序列核苷酸同源性差异。
1.3.3 FIV将另外一份待检样品经0.22µm滤膜过滤后尿囊腔接种到10日龄SPF鸡胚中，37℃孵化箱中培养，每24 h照胚1次，并将死亡鸡胚及时保存至4℃冰箱，96 h后将所有鸡胚放至4℃冰箱过夜，收获鸡胚尿囊液，测定其血凝性；如有血凝性则作进一步鉴定，没有血凝性则进行盲传，收获第3代鸡胚尿囊液作进一步鉴定；对鸡胚尿囊液进行HA试验，根据文献合成引物对HA和NA编码序列进行测定（HA上游：GGGGAATTTCACAACCACTCAAG；HA下游：TTGAGTAGAAACAAGGGTGTTTC。NA上游：AGCAAAAGCAGGAGTRAAAATGA；NA下游：GGCAAGTAGAAACAAGGAGTT）。扩增片段HA为1 742 bp，NA为1 457 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR扩增后经1%琼脂凝胶电泳检测。
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