摘要
背景
在此，我们报告了通过使用qPCR精确测定寄生虫载量并结合荧光和生物发光成像（BLI）来监测克氏锥虫在长红猎蝽消化道中的定植情况。这些互补的方法揭示了寄生虫种群定植昆虫肠道并建立媒介感染所必需的关键步骤。
方法学/主要发现
对昆虫肠道中寄生虫载量的qPCR分析显示出一些局限性，这主要是由于存在消化衍生产物，这些产物被认为会降解DNA并进一步抑制PCR反应。我们开发了一种实时PCR策略，靶向克氏锥虫重复卫星DNA序列，并使用作为内标进行归一化的外源异源DNA（加入昆虫样品提取物中），以精确量化昆虫肠道每个区段（前中肠AM、后中肠PM和后肠H）中的寄生虫载量。通过结合荧光显微镜和BLI成像以及qPCR分析，我们发现在寄生虫穿越昆虫消化道的旅程中，大多数寄生虫在最初24小时内在AM中被裂解，这一过程与肠道微生物群无关。在这段短暂的时间内，存活的寄生虫穿过PM以建立感染的起始。在感染后第3-4天，寄生虫种群开始定植于H，并在第7天达到顶峰，并在接下来的两周内维持这一水平。值得注意的是，在重新进食后的两周内，H中寄生虫数量的波动保持相对稳定，而存在于AM和PM中的种群略有增加，可能构成了分裂型上鞭毛体的储存库。
结论/意义
这些数据表明，昆虫肠道中存在一种经过微调的动态种群控制机制，以维持非分裂型感染性锥鞭毛体形式与分裂型上鞭毛体形式之间的平衡，这对于媒介能力至关重要。
作者总结
尽管克氏锥虫生命周期的关键方面在一个多世纪前就已描述，但其在媒介体内的发育和相互作用却鲜有表征。通过在不同时间间隔解剖锥蝽（原型为长红猎蝽）肠道（即AM、PM和H）的不同区段，我们使用精确的qPCR检测评估了锥虫在昆虫体内的发育情况。通过体内荧光和生物发光成像证实了锥虫定植和清除动力学的实时qPCR分析，揭示了在进食后最初24小时内发生的大规模寄生虫裂解。一周后，寄生虫成功地在肠道的每个区段建立了常驻种群，尽管水平各不相同。从感染开始一周后，AM和PM中的一些常驻形式聚集成玫瑰花结，与媒介组织紧密相关地聚集在一起，构成了昆虫体内潜在的寄生虫储存库。我们首次描述了一种精确量化昆虫肠道中寄生虫的方法，该方法将成为评估在克氏锥虫感染过程中RNAi沉默昆虫基因影响的有用工具。
引言
恰加斯病被认为是拉丁美洲一种被忽视的主要寄生虫性热带疾病，在21个流行国家影响700-800万人，每年导致12,000人死亡（http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/）。由于受感染对象向非流行、更发达地区（主要是北美和欧洲）的迁移，该病现在已成为一个日益严重的全球公共卫生问题，在这些地区，他们可能通过输血、器官捐献或怀孕传播该病。许多慢性感染者会发展为严重且不可逆的心血管、胃肠道和/或神经系统问题，导致生产力损失和高昂的医疗费用。
恰加斯病的病原体是原生动物克氏锥虫，在流行地区主要通过吸血性锥蝽昆虫传播。在140种锥蝽中，长红猎蝽是中美洲和南美洲恰加斯病最重要的媒介之一，几十年前被研究人员选为恰加斯病传播研究的原型，主要是因为它自1930年代以来一直被用作昆虫生理学和生物化学研究的模型。虽然克氏锥虫生命周期的一些主要特征在一个多世纪前就已描述，但寄生虫在其媒介体内的完整发育过程仍然鲜有表征。在其复杂的生活史中，寄生虫会遇到剧烈的环境变化（例如温度和pH），伴随着重大的形态和生化变化，并在增殖和非增殖阶段之间循环切换。当锥蝽以受感染的脊椎动物宿主为食时，血液中的锥鞭毛体被摄入，并在前中肠（AM）主要分化为上鞭毛体形式。这些上鞭毛体主要在后中肠（PM）复制，并可以附着在覆盖肠道细胞的微绒毛周围膜上。其中一些上鞭毛体附着在后肠（H）壁上，并分化为感染性循环后期锥鞭毛体，随排泄物释放。在昆虫以哺乳动物宿主的血液为食期间，受污染的粪便和尿液被释放到脊椎动物宿主的皮肤上，随后通过抓挠叮咬伤口或经由粘膜进入血液。
对昆虫肠道不同区段中克氏锥虫的发育、分布以及定量的分析主要基于光学显微镜方法。迄今为止，尚无标准化检测方法可用于量化肠道中低水平存在的寄生虫。使用Neubauer血细胞计数板计数的经典技术已被用于量化整个匀浆物或肠道内容物以及排泄物样品中的克氏锥虫。尽管对于快速定量和比较含有高寄生虫载量的样品很有用，但该方法对于含有低寄生虫载量的样品既不准确也不具统计学意义，这在野外很常见。事实上，每微升少于一个寄生虫的样品无法使用Neubauer计数室进行计数。此外，通过显微镜计数肠道样品中的寄生虫经常受到AM中高浓度红细胞、PM和H中血红素聚集体以及H中尿酸盐晶体的阻碍。此外，区分不动的寄生虫与组织碎片以及计算形成玫瑰花结的寄生虫的确切数量可能很复杂。最近，使用生物发光克氏锥虫揭示了在昆虫肠道内体内追踪寄生虫分布的可行性，从而提供了观察寄生虫生命周期中涉及媒介-寄生虫相互作用的生物学相关特征的可能性。类似地，使用GFP标记的克氏锥虫作为受感染宿主生物学研究的显微镜工具先前已有报道。
与经典技术相比，基于分子的检测方法（如定量实时PCR（qPCR））允许更灵敏的定量分析，因为这些技术能够特异性扩增寄生虫DNA序列靶标。然而，从完整的锥蝽肠道中提取的DNA样品进行PCR扩增可能会受到共纯化的几种潜在PCR抑制剂的抑制，例如肝素（在人工感染过程中添加到血液中以防止凝固）、多糖（例如，由微生物群产生的多糖）、血红蛋白（在AM中溶血释放）、血色素（血红素聚集体，类似于在PM中产生的hematin）以及可能的尿酸（嘌呤代谢的终产物，在H中含量很高）。
本研究的首要目的是描述一种允许从锥蝽肠道匀浆物中分离无PCR抑制剂DNA的提取方案，并开发和评估一种用于定量这些样品中克氏锥虫载量的高灵敏度和精确的qPCR检测方法。在此，通过将这种高灵敏度和精确的qPCR策略与定性成像分析（荧光显微镜和BLI检测）相结合，我们提供了对昆虫肠道定植动力学的新见解，揭示了克氏锥虫生命周期的几个关键特征。
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