2.3耐冻酵母菌菌落及分子生物学鉴定
通过对比分析，Y2酵母菌株的生长特性耐冻性及产气能力优于其他几株酵母菌，因此对Y2菌株进行分子生物学鉴定，测序结果在NCBI进行BLAST对比，通过邻接法构建系统发育树。如图2所示，Y2是一株酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，其菌落形态呈乳白色黏稠状、表面光滑整齐且质地均匀，形态凸起明显，细胞形态为圆球形或椭圆形。酿酒酵母菌普遍具有良好的生长适应性，耐受温度范围广，兼具产酯增香提升风味的作用，在酿酒、发酵食品等领域应用广泛。其代谢机理复杂，能够通过糖酵解途径，在酶促反应作用下产生醇类、酸类等芳香化合物，改善产品风味特性。
a-菌落;b-细胞形态(400倍);c-系统发育树
图2 Y2酵母菌菌落、细胞形态及系统发育树
2.4耐冻酵母发酵面团感官评定
在冷冻面团中，酵母活性的丧失和面团结构的破坏是面团品质下降的主要原因。而冷冻生坯面团在产气快、活性强的耐冷冻酵母作用下能够在二次醒发过程中快速成型，维持产品良好的柔软质地和弹性。将耐冻产香酵母Y2与3种市售酵母菌剂(标记为S1～S3)，在相同条件下(相同添加方式、相同数量级)制备成面团，经40 d冷冻后取出，二次醒发后从颜色、结构、风味等方面进行感官评价，结果如图3所示。由于冷冻带来的影响，各组面团老化程度不同，普遍存在表皮皱缩、凹陷，容易掉碎屑等现象，色泽不均匀、口感粗糙等问题，品质感官劣变。其中酵母Y2感官评价总分为84.2分显著高于其余3组，尤其在咀嚼性、组织结构上明显优于市售普通酵母菌，说明耐冻酵母菌株对于面团冷冻后的劣变具有改善作用，能够减少低温环境下对面团组织结构、水分迁移造成的影响，在二次醒发过程中能够提升一定的感官特性。
图3不同冷冻面团的感官评定图
2.5耐冻酵母发酵面团香气成分分析
由图4-a及表3可知，在冷冻面团香气物质中，醇类、酯类和酸类物质含量较高。酵母菌通过Ehrlich代谢途径及醛类物质氧化可生成醇类物质，通常具有酒香味及清香味，酸类化合物则是某些风味物质的前体。醇类风味化合物在S2样本中占比最高达到40.67%，酸类物质在S3样本中占比达到30.51%。而酯类化合物由酸和醇的酯化反应产生，该类风味物质阈值低，大多具有花、果的芳香气味，含量较低的情况下也对香气具有较大贡献。Y2样本酯类风味化合物含量占28.39%，高于其他样本。醛类化合物一般来说在低浓度时对气味起到积极作用，浓度较高时则会产生令人不悦的异味。酮类、烷烃类化合物由脂质的氧化分解形成，对香气基本无贡献，在面团中占比较低。
a-挥发性风味物质相对含量;b-差异挥发性物质VIP值;c-共有香气成分PLS-DA;d-关键差异物质热图
图4不同发酵组面团挥发性风味物质相对含量、差异挥发性物质VIP值、共有香气成分PLS-DA及关键差异物质热图
表3不同挥发性风味物质的相对含量
各组间风味成分占比差异并不明显，在醇、醛类类香气物质中，乙醇、异戊醇、正己醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、正壬醛、反-2-壬醛的含量较高，正己醇由亚油酸氧化和酵母代谢生成，具有水果香气，是面粉中主要醇类物质，这与赵畅雯等、高雪等的研究结果一致。而异戊醇和苯乙醇分别由亮氨酸和苯丙氨酸脱羧转化而来，带有甜香、玫瑰香等香气，酿酒酵母经由Ehrlich途径能够高效完成该过程的转化。在面团混合和发酵过程中，这些挥发性醇类、醛类化合物作为基础风味物质，能够赋予样本不同风味特色。
由表3可知，Y2组含有香气物质54种，其中醇类14种，醛类13种，酯类14种，酸类7种，酮类1种，烷烃类5种。S1香气物质为56种，S2香气物质为57种，S3香气物质为40种。对各组面团中共有的21种香气物质相对含量进行PLS-DA，能够对组间风味成分特征进行有效区分，解释不同发酵组面团中风味物质差异。将VIP值≥1的风味物质定义为对风味具有较大贡献的差异物质。如图4-b和图4-c可知，差异标志物质共11种，其中醇类4种，酸类1种，酯类2种，醛类4种。Y2组与S3组样本间距离接近，处于同一象限，且两个样本与大部分关键差异风味物质具有关联性，说明两种酵母发酵后的面团风味具有一定相似性。以不同冷冻面团中11种关键差异风味物质相对含量绘制热图，根据图4-d结果，Y2和S3中关键差异风味物质含量显著高于其他几组，与PLS-DA结果一致，表明了Y2发酵面团冷冻后关键的醇类、酯类、醛类等风味化合物相对含量高于其他菌株，其香味特征更具复杂性和独特性。因此耐冻酵母菌Y2在冷冻面团中的应用效果和风味促进作用优于普通酵母菌剂。
3讨论与结论
从传统老面团中筛选了5株产香、耐冻性能良好的酵母菌株。对酵母菌生长活性、产气性能、冷冻存活性和应用于面团后的质构特性进行测定。结果表明:Y2菌株具有较强的抗冻稳定性，发酵力及生长活性优于其他菌株，Y2发酵面团冷冻后二次醒发具有更高的比容且更佳的质构特性。经分子生物学鉴定，Y2是1株酿酒酵母菌，对比分析了该菌株与3款市售酵母菌剂相同条件下应用于冷冻面团的感官与风味差异。添加Y2组含有香气物质54种，其中醇类14种，醛类13种，酯类14种，酸类7种，酮类1种，烷烃类5种。经PLS-DA，以VIP值≥1筛选了具有较大贡献的11种差异风味物质并绘制热图，Y2中关键的醇类、酯类、醛类等风味化合物相对含量高于其他菌株，结合感官评定结果，耐冻酵母菌Y2在冷冻面团的应用效果和风味促进作用优于普通酵母菌剂。