A型塞内卡病毒（Senecavirus A，SVA）属于RNA病毒科（Picornaviridae）塞内卡病毒属（Senecavirus）成员，目前仅有一个型，与心病毒属（Cardioviruses）成员亲缘关系较近。SVA感染可引起猪口鼻部及冠状带出现水泡样病变，同时可伴随跛行、厌食、嗜睡、皮肤充血、发热等症状，与口蹄疫（FMD）、猪水泡病（SVD）、水泡性口炎（VS）等疫病难以区分。SVA为单股正链RNA病毒，其基因组全长约7.3 kb，包含由666个核苷酸组成的5'端非编码区（UTR）。非编码区后是1个单一的长开放阅读框，编码2 181个氨基酸组成的多聚蛋白，可被切割成12个多肽，包括先导蛋白（L）、4个结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和7个非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）。SVA 3'端非编码区有71个核苷酸，后面连有poly（A）尾巴。
反向遗传技术已经广泛应用于各类RNA病毒研究。该技术可实现在分子水平上对病毒定向改造，为RNA病毒基因功能及致病机理研究、新型疫苗研制等提供了有效方法。RNA病毒的主要反向遗传学方法是，基于质粒系统递送病毒全长cDNA，细胞内cDNA能在RNA聚合酶启动子的作用下被转录成为病毒RNA，这些RNA随后被翻译成多肽并被加工为成熟的病毒结构与非结构蛋白，与病毒RNA一起包装成具有感染性的病毒粒子。据报道，已有的SVA反向遗传平台构建主要基于酶切连接方法，这种方法是通过RT-PCR在体外扩增病毒基因片段，利用限制性内切酶，特异性地将片段逐个构建到质粒载体上，这种方法需要进行酶切、连接、单克隆鉴定、测序等复杂程序，出错率高，耗时较长。
本研究拟利用同源重组法一次性将SVA全基因组片段、CMV启动子、poly（A）尾巴及丁肝核酶序列（HDVr）等元件整合进低拷贝载体pWSK-29中，构建SVA全长感染性克隆（pWSK-29-SVA），并拯救出与亲本毒株生物学功能一致的重组病毒（rSVA），以期缩短反向遗传平台构建时间，为进一步研究SVA致病机理、研制新型疫苗奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病毒、细胞、载体SVA-GXT91毒株，由本实验室分离、保存；BHK-21细胞、pWSK-29质粒、EGFP N2质粒，为本实验室保存。
1.1.2主要试剂
病毒RNA/DNA核酸自动提取试剂盒，购自西安天隆科技有限公司；反转录酶、高保真DNA聚合酶、同源重组酶、DH5α感受态细胞，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒，购自Qiagen公司；质粒抽提试剂盒，购自天根生化科技有限公司；全自动微生物生长曲线分析仪，购自Bioscreen公司；DMEM培养基、Lipofectamine 3000，购自Invitrogen公司；胎牛血清，购自金源康生物工程有限公司。
1.2方法
1.2.1引物设计构建方案如下：以EGFP N2质粒为模板，设计含有同源臂的CMV启动子引物，以SVA-GXT91 RNA为模板设计含同源臂SVA基因全长引物（表1）。含同源臂的poly（A）尾巴+HDVr，由引物自结合扩增形成。
表1构建SVA感染性克隆的引物序列
1.2.2感染性克隆构建
以pWSK-29为载体，采用同源重组技术构建pWSK-29-SVA感染性克隆。以SVA-GXT91 RNA为模板，扩增SVA病毒基因片段；以引物为模板，自结合扩增poly（A）+HDVr；以EGFP N2质粒为模板，扩增CMV启动子。将pWSK-29载体酶切线性化，与SVA全基因组、CMV启动子及poly（A）+HDVr按比例混合，在同源重组酶ExnaseMulitS催化下，37℃反应30 min即可完成同源重组结合，实现体外环化。100μL感受态细胞置于冰上融化后，加入10μL构建好的SVA感染性克隆质粒，轻摇混匀，冰上静置30 min；随即在42℃水浴中热激90 s，迅速置于冰上2 min，然后置于800μL无抗生素的LB培养液中37℃摇床震荡（180 r/min）45 min；以4 000 r/min离心5 min，弃去部分上清，将剩余100μL液体吹吸混匀，涂布在氨苄抗性LB培养板上；将培养板倒置在37℃恒温箱中培养过夜，并于次日菌落长出后进行菌落PCR鉴定。