1.2.2生长曲线测定
在超净台中挑取纯化后的单菌落接种于TSB液体培养基（含10µg/mL NAD溶液）中，置于37℃摇床，180 r/min培养过夜，次日按照1%比例（体积比）转接于新TSB液体培养基（含10µg/mL NAD溶液）中，再放置于37℃摇床，180 r/min培养，分别在0、2、4、6、8、10和12 h时间点取出100μL菌液测定OD600nm值。
1.2.3溶血活性测定
将无菌绵羊血按照体积比5%比例加入TSA培养基（含10µg/mL NAD溶液）中，配制绵羊血平板。挑取临床单个菌落均匀地点在培养基上，每个菌4个重复，随后将平皿倒置在37℃恒温培养箱中培养18~24 h，观察是否有溶血情况以及溶血环大小。
1.2.4耐药性检测
从-20℃取出抗生素贮存液，解冻混匀后，取适量MH培养基稀释至适宜浓度。梯度稀释抗生素（第1孔200μL，其余各孔100μL MH培养基），第11孔加入菌液，第12孔为对照。每孔加入100μL菌液混匀，终浓度约5×105 CFU/mL。96孔板中，每孔中加入1×108 CFU/mL菌液100μL。37℃培养24 h后，根据2020版美国临床和实验室标准协会（CLSI）中的标准，首个澄清孔抗生素浓度为MIC（最小抑菌浓度），参考流感/副流感嗜血杆菌标准分析。
1.2.5大蜡螟模型初步筛选疫苗候选菌株
本研究使用大蜡螟和小鼠模型对分离菌株进行毒力筛选，首先用大蜡螟模型对菌株数量较多的血清1型、7型进行筛选，其他血清型菌株数量较少，直接进行后续小鼠筛选试验。将0.4~0.5 g大蜡螟幼虫分组，每组10只，注射APP血清型1型和7型菌液，设生理盐水组和空白对照组。注射剂量25μL/只，约1.0×106 CFU/只，37℃避光培养24 h，记录死亡情况（通体变黑且不动为死亡）。试验重复2次。初步筛选出毒力较强的血清1型和7型菌株。
1.2.6小鼠模型筛选高毒力疫苗候选菌株
将78只4周龄KM雌鼠随机分为13组，每组6只，采用腹腔注射进行感染，其中4组感染1型菌株（6×106 CFU/只），2组感染7型菌株（8×108 CFU/只），4组感染15型菌株（4×108 CFU/只），3组感染5型菌株（1×107 CFU/只）。观察3 d，统计小鼠死亡率和症状，选择各血清型毒力最强的菌株进行后续试验。
1.2.7疫苗候选菌株LD50（半数致死量）测定
将120只4周龄昆明雌鼠随机分成20组，每组6只。血清型1型菌株3-7选用1.6×107、8×106、4×106、2×106和1×106 CFU/只5个剂量进行攻毒；血清型5型菌株4-3选用4×107、2×107、1×107、5×106和2.5×106 CFU/只5个剂量进行攻毒。血清型7型菌株选用5×108、1.3×108、3×107、7.8×106和2×106 CFU/只5个剂量进行攻毒；血清型15型菌株选用1×109、5×108、2.5×108、1.3×108和6×107 CFU/只5个剂量进行攻毒。
同时设置对照组，注射等量生理盐水，均采用腹腔注射的攻毒方式，攻毒后观察3 d，统计死亡率，根据改进寇氏法计算LD50，计算公式为LD50＝lg-1［Xm-i（∑P-0.5）］（Xm—最大剂量的对数；i—组间距相邻两组对数剂量的差值；P—各组动物的死亡率；∑P—各组动物死亡率的总和）。
1.2.8疫苗候选菌株灭活疫苗的制备及免疫
将候选菌株进行复苏并传代，在TSB液体培养基中，培养至对数中期，6 000 r/min离心5 min，PBS洗3次后用PBS重悬。按总体积加入0.4%甲醛溶液，于37℃180 r/min振荡灭活24~48 h。灭活后取灭活菌液进行TSA平板划线，同时进行TSB培养基液体培养，进行灭活效果检测。根据试验设定的免疫剂量（单价疫苗剂量为菌株LD100的两倍；用PBS调整浓度，与铝佐剂1∶1配比，制成灭活疫苗，置4℃保存备用。使用6周龄Balb/c雌鼠作为实验对象，试验分组见表2。首次免疫记为第0天，第13天小鼠采血分离血清，第14天进行二免，第27天小鼠采血分离血清，第28天进行攻毒（各血清型候选菌株的LD100）。期间观察各组小鼠精神状况及死亡情况。同时设置阴性对照和商品化疫苗对照（猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗），商品化疫苗含有1、2、7型菌，且每种菌抗原含量均≥5×108 CFU/mL，即≥1×108 CFU/只。
表2灭活疫苗免疫程序及免疫剂量
1.2.9抗体水平检测
全菌蛋白制备：将候选菌株进行培养至对数生长期，收集菌体并用PBS重悬，超声破碎后离心取上清即为全菌蛋白，BCA法测定蛋白浓度后液氮速冻保存。将候选菌株的全菌蛋白用包被液包被后，ELISA板中每孔加入100μL，4℃包被过夜。弃去包被液，每孔加200μL PBST洗涤液清洗3次。每孔加入300μL脱脂乳封闭液，37℃封闭2 h。弃去封闭液，PBST洗涤液清洗3次。每个样品用PBST将其稀释160倍后每孔加入100μL，37℃孵育1 h。弃一抗，PBST洗涤液清洗3次。用PBST按1∶3 000稀释羊抗鼠酶标二抗，每孔100μL，37℃孵育1 h。弃二抗，PBST洗涤液清洗3次。每孔加入100μL TMB底物显色液，37℃避光显色20 min，用酶标仪测定OD630nm处的吸光度。
1.2.10疫苗候选株传代稳定性检测
将筛选出的候选菌株接种于TSB液体培养基中，置于37℃摇床，180 r/min培养过夜，次日按照1%比例（体积比）转接于新TSB液体培养基中，再放置于37℃摇床，180 r/min培养。12 h后按1%比例（体积比）转接于新TSB液体培养基，为传代一次，按照此操作连续传代30次，使用候选菌株的10代、20代、30代菌株分别以致死剂量感染小鼠，每组6只，观察小鼠存活情况。
1.2.11数据统计学分析
本文所采用的统计学分析均使用GraphPad Prism 8.0软件计算各组数据的平均值和标准差，采用t检验对各组数据进行差异显著性分析。P>0.05为差异不显著（ns），P<0.05为差异显著(*)，P<0.01为差异极显著(**)，P<0.001为差异极显著(***)。
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