摘要
从开菲尔粒中分离并通过DNA测序鉴定的开菲尔乳杆菌菌株，被检测其与益生菌相关的特性。该菌株对0.4%（w/v）胆汁完全耐受，但对酸仅表现出中等耐受性。它在补充益生元化合物（两种低聚果糖、低聚半乳糖（GOS）和乳果糖）的培养基上生长良好，当GOS添加到共培养基中时观察到对单核细胞增生李斯特菌的显著灭活作用，而大肠杆菌未受到显著影响。数据表明酸化不是灭活的唯一原因，因为其他益生元引起的类似pH下降并未导致对单核细胞增生李斯特菌的可比灭活。本研究中从开菲尔粒中分离的开菲尔乳杆菌显示出作为益生菌的潜力，这是开发功能性产品的第一步。现有数据表明，它与GOS的合生素组合最为有效。
1. 引言
开菲尔是一种通过用开菲尔粒孵育牛奶获得的酸性发酵乳制品，被认为是具有已知健康益处的天然益生菌。开菲尔粒是凝胶状不规则颗粒，直径从几毫米到2-3厘米不等。它们类似于白色或淡黄色花椰菜花球，含有主要由酵母、醋酸菌和乳酸菌组成的复杂微生物群。在发酵过程中，颗粒重量增加，收获的额外生物质用于新的发酵。最近一项研究表明，使用PCR-变性梯度凝胶电泳，在三个测试的开菲尔粒中，开菲尔乳杆菌和开菲尔乳杆菌kefiranofaciens是主要的细菌种群。虽然已发表大量关于开菲尔粒微生物分类学的研究，但很少有研究调查单个物种如开菲尔乳杆菌的益生菌潜力。
益生菌被定义为当摄入足够数量时，对宿主健康有益的活微生物。益生菌生物的理想特性包括明确的属/菌株、已证明的安全性、对胃酸和胆汁分泌的 proven 抗性、粘附肠道上皮组织的能力、产生抗菌物质和对抗病原体的拮抗活性、调节免疫反应以及在技术过程和最终产品中保持活性和活力。为了增强益生菌的功效并促进本土有益细菌的生长，益生元作为潜在食品成分被引入。一种碳水化合物要被定义为益生元，需要被选择性发酵，从而导致胃肠道微生物群组成和/或活性的特定变化，从而对宿主健康产生益处。作为益生元引起大量关注的食品成分是低聚糖。低聚糖在其链结构中平均含有多达10个线性或分支的单体单元。糖苷键使其能够抵抗消化酶，但可以被细菌代谢。它们天然存在于朝鲜蓟、洋葱、菊苣、大蒜、韭菜等商品中，在谷物中含量较少。不可消化低聚糖（NDO）包括菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖和乳果糖，这些是研究最广泛的益生元。
益生菌和益生元的组合被称为合生素，应满足益生菌和益生元两者的要求。
本研究的目的是：检测从开菲尔粒中分离并通过分子鉴定的开菲尔乳杆菌耐受酸和胆汁的能力；选择适合的低聚糖/益生元以促进其生长；并研究合生素对肠出血性大肠杆菌O157:H7和单核细胞增生李斯特菌的抗菌效果。
2. 材料与方法
2.1. 开菲尔粒的制备
本研究中使用的开菲尔粒在室内保存，源自希腊中马其顿地区。颗粒在25°C下于UHT脱脂牛奶中生长4周，不搅拌。每天，颗粒用无菌水洗涤并添加新鲜脱脂牛奶。
2.2. 开菲尔乳杆菌的分离
使用无菌研钵和研杵在1 mL 1 g/L胰蛋白胨中将开菲尔粒破碎。取10 g碎开菲尔粒与90 mL林格溶液在实验室搅拌器中高速均质15分钟。为了计数乳杆菌，将匀浆的适当系列稀释液0.1 mL涂布在de Man、Rogosa和Sharpe琼脂（MRS）和Rogosa琼脂平板表面。平板在37°C好氧培养48小时。将选定的分离菌落划线到MRS琼脂上，在37°C好氧培养48小时。纯化分离物通过细胞形态、革兰氏染色和过氧化氢酶反应进行表征，并根据显示表型差异的菌落选择五个进行进一步分析。
2.3. 细菌DNA提取和测序
将分离菌株的细胞在MRS肉汤中好氧条件下37°C培养48小时。按照制造商说明使用DNeasy血液和组织试剂盒分离和纯化染色体DNA。使用聚合酶链反应（PCR）扩增菌株的16S rDNA基因。反应混合物（50 mL）包含25 mL Taq PCR Master Mix、1 mL各5 mM通用引物（pA和pH）和1 mL各细菌菌株模板DNA（0.1 mg），置于洁净无菌管中。将试管内容物混合并置于热循环仪中，初始变性步骤94°C 3分钟，然后30个循环：94°C 30秒，60°C 30秒，72°C 2分钟。最后72°C 10分钟，然后冷却至4°C。对每个PCR产物，加入4 mL至1 mL 6×上样缓冲液，在含0.5 g/mL溴化乙锭的琼脂糖凝胶（1%，w/v）上分析。凝胶在100 V下运行30分钟，在紫外透射仪上观察。按照制造商说明使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。使用毛细管DNA分析仪进行测序。
2.4. 菌株
分析核苷酸序列数据（总计1394 bp），并将新测定的序列与公共数据库中可用的序列进行比较。使用BLAST算法评估与其他序列的相似性，并根据最高得分确定分离物的身份。所有五个菌株B6、C1、D1b1、A4、F4Aa（实验室编号）被鉴定为开菲尔乳杆菌，并被赋予以下唯一的GenBank登录号：KC964538、KC964539、KC964540、KC964541和KC964542。随机选择开菲尔乳杆菌B6进行进一步研究。肠出血性大肠杆菌O157:H7 NCTC 12900和单核细胞增生李斯特菌Scott A也用于实验。储备培养物在-70°C使用Microbank冷冻管保存，直至需要。
2.5. 酸耐受性
实验按照先前描述的方法进行，稍作修改。简要地，将开菲尔乳杆菌B6划线到MRS琼脂上，37°C好氧培养48小时。将单个菌落接种到MRS肉汤中，在相同条件下培养。取1 mL肉汤等分试样，通过离心（3000×g，15分钟）用四分之一强度（q-s）林格溶液洗涤三次。细胞沉淀重悬于1 mL q-s林格溶液中，最终浓度为10^9 cfu/mL，接种到9 mL pH 3或pH 2.2的甘氨酸-HCl缓冲液中。缓冲液通过用0.2 M HCl调节0.2 M甘氨酸储备溶液的pH，并用蒸馏水稀释至0.05 M甘氨酸制备。混合物在37°C孵育2小时，在特定时间点（接种前、15、30、45、60和120分钟）取1 mL等分试样，在q-s林格溶液中系列稀释，100 mL涂布到MRS琼脂上。平板在37°C培养48小时，然后计数菌落。
2.6. 胆汁耐受性
胆汁耐受性测定按照先前描述的方法进行，稍作修改。简要地，开菲尔乳杆菌B6的培养、洗涤和重悬如上所述。将100 mL等分试样接种到9.9 mL PBS（pH 7.3）或含0.4%（w/v）牛胆汁的9.9 mL PBS中，37°C孵育6小时。从每个培养悬浮液中取1 mL等分试样，在q-s林格溶液中系列稀释，在不同测试点（接种前和接种后立即、1、2、3、4、5和6小时）100 mL涂布到MRS琼脂平板上。平板在37°C培养48小时，然后计数菌落。
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