1.5 TCGA数据库分析
分析TCGA数据库中膀胱癌的生存数据和目的基因的预后相关性。
1.6慢病毒转染实验
为构建稳定敲低表达CLDN10的膀胱癌细胞株，将含sh-CLDN10的慢病毒质粒(Lipofectamine3000，Invotrigen，美国)感染293-T细胞，72 h后收集病毒液。然后将病毒液感染膀胱癌T24细胞，48 h后在显微镜下观察荧光蛋白的表达情况。确认转染成功后将T24细胞用胰酶消化，分装冻存。将敲低表达CLDN10膀胱癌T24细胞作为敲低CLDN10组，以未转染的膀胱癌T24细胞作为对照组。
1.7 CCK-8检测
用Bioscreen C 公司全自动生长曲线分析仪检测细胞生长情况。96孔板培养细胞，待细胞长到80%~90%时，按预先设计的时间点测定细胞的生长值，在时间点之前30~120 min每孔加入20μL CCK-8试剂(100μL培养基加入10μL试剂)，继续培养。采用酶标仪在450 nm波长处测量各孔光密度值，然后根据所测值计算并绘制生长曲线。
1.8细胞克隆实验
接种细胞到6孔板，每孔接种约500个细胞，培养5~7 d后肉眼可见克隆时，甲醇固定30 min、结晶紫液染色30 min后，在镜下观察细胞克隆数。
1.9统计学分析
采用SPSS 19.0统计软件包分析和处理数据，每组实验独立重复3次，实验数据以x±s表示，采用两独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1免疫组化检测膀胱癌组织中免疫细胞的浸润情况
免疫组化结果表明，除CD3、CD8外，巨噬细胞表面特征性CD68分子在癌细胞周围的间质中染色呈强阳性，而CD68在癌旁正常组织中的染色呈阴性(图1)。
A：膀胱癌组织；B：癌旁组织
图1膀胱癌组织及癌旁组织中免疫细胞表面特征性分子的表达
2.2免疫组化检测膀胱癌组织中巨噬细胞的浸润情况
免疫组化结果表明，M2巨噬细胞表面特征性分子CD163在膀胱癌组织中表达呈强阳性，而M1巨噬细胞表面特征性分子iNOS则表达阴性(图2A)；iNOS和CD163分子在癌旁正常组织表达阴性(图2B)。
A：膀胱癌组织；B：癌旁组织
图2巨噬细胞表面特征性分子在膀胱癌组织的表达
2.3膀胱癌及癌旁组织全转录组测序结果
对10对膀胱癌及对应癌旁组织进行转录组测序，结果表明，癌组织和癌旁组织间有4 640个差异表达基因(Fold change>2，FDR<0.05，图3A)。采用软件分析筛选出膀胱癌组织中巨噬细胞浸润高低两组间的差异表达基因(图3B)。将A、B两组基因进行交叉性分析，筛选出两者间共同调控的表达基因，其中CLDN10基因表达明显升高，最为显著(图3C)。
A：癌组织和癌旁组织间的基因表达差异；B：巨噬细胞浸润评分高低两组间的基因表达差异；C：软件分析筛选出A、B两组间的共同差异表达基因
图3两组间基因表达差异热图
2.4免疫组化检测CLDN10在膀胱癌组织的表达部位
为明确CLDN10在膀胱癌组织的表达部位，选取膀胱癌组织石蜡切片进行IHC实验，结果显示，CLDN10表达于膀胱癌细胞的胞质和胞膜部位(图4)。
图4免疫组化检测CLDN10在膀胱癌组织的表达
2.5 Western blot检测CLDN10在膀胱癌组织中的表达
提取10对膀胱癌组织的蛋白液后进行Western blot检测，结果显示，CLDN10蛋白在膀胱癌组织中的表达升高，而在癌旁组织中表达相对较低(P<0.05，图5)。
A：Western blot检测结果T：膀胱癌组织；N：癌旁组织；1~10：为标本序号；B：蛋白半定量分析a：P<0.05，与癌组织比较
图5 Western blot检测CLDN10在膀胱癌和癌旁组织中的表达
2.6 CLDN10促进膀胱癌细胞的生长和增殖
为探讨CLDN10在膀胱癌细胞生长和增殖中的作用情况，首先用慢病毒转染的方法构建稳定低表达CLDN10的膀胱癌T24细胞株(图6A)。然后用CCK-8试剂检测膀胱癌细胞的生长能力，平板克隆实验检测膀胱癌细胞的增殖能力。结果表明，与对照组相比，敲低CLDN10组膀胱癌细胞的生长能力明显减弱(图6B)，细胞克隆形成数目明显减少(198.0±10.3 vs 145.0±8.4，P<0.05，图6C)。
A：Western blot验证稳定敲低CLDN10的膀胱癌T24细胞株；B：CCK-8检测膀胱癌细胞的生长曲线；C：平板克隆实验检测膀胱癌细胞的克隆形成能力(n=3)
图6检测敲低CLDN10表达后膀胱癌细胞的生长和增殖能力变化
2.7 TCGA数据库中CLDN10与膀胱癌患者的预后分析
利用TCGA数据库分析CLDN10与膀胱癌患者的预后，结果显示CLDN10高表达的患者预后较差(图7)。
图7 TCGA数据库中CLDN10与膀胱癌患者预后的关系
2.8敲低CLDN10后膀胱癌细胞上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)相关蛋白的表达
为检测敲低CLDN10对膀胱癌细胞EMT的影响，用Western blot检测膀胱癌细胞中部分EMT相关蛋白的表达情况。结果显示，敲低膀胱癌T24细胞CLDN10的表达后，Snail1、Vimentin、Twist蛋白表达水平下降，而E-cadherin蛋白表达水平升高(图8)。
a：P<0.05，与对照组比较
图8 Western blot检测膀胱癌细胞内部分EMT指标蛋白表达水平