2.3.最低抑菌浓度（MIC）与棋盘法检测
MIC assays 如先前描述进行。GIB-C1141144 和 GRI-C1210932的孵育时间延长至48小时，因为这些菌株生长比K56-2慢得多。棋盘格 assays 用抗生素组合进行。当可以确定MIC时（新生霉素、氯新生霉素和妥布霉素），使用在1/32x MIC和MIC值之间以两倍递增的浓度。例如，如果某菌株的新生霉素MIC为16μg/mL，则在棋盘格 assay中测试0.5、1、2、4、8和16μg/mL的浓度。无法准确确定PMB和粘菌素对BCC细菌的MIC，因为这些细菌在生长培养基中高于这些化合物的溶解度浓度下生长。所有BCC菌株在1024μg/mL PMB和粘菌素中生长，这是测试的最高浓度。这些被视为所有检查BCC菌株的MIC的一半。
在棋盘格 assays中，PMB和粘菌素在64（1/32x MIC）、128（1/16x MIC）、256（1/8x MIC）、512（1/4x MIC）和1024μg/mL（1/2x MIC）浓度下测试。分数抑制浓度指数（FICI）计算为 FICI = [(A)/MICA] + [(B)/MICB]，其中(A)和(B)是药物A和B在组合中抑制细菌生长所需的MIC，MICA和MICB是药物A和B单独的MIC。FICI ≤0.5被视为协同作用。对于协同研究，所有抗生素来自独立供应商：新生霉素（>90%纯）、PMB（>60%纯）、粘菌素（>50%纯）和妥布霉素（>98%纯）购自Sigma（St Louis, MO）。商业级氯新生霉素由Rhone-Poulenc Santé捐赠。新生霉素和氯新生霉素对实验BCC菌株组的MIC也使用常规肉汤稀释法确定。MIC和棋盘格实验独立重复最多四次。在重复之间获得多个值的情况下，报告较大（更保守）的值。
3.结果
3.1.小分子筛选多粘菌素B协同剂
图1.从2686种化合物库中，5种化合物显示出与500μg/mL多粘菌素B（PMB）对洋葱伯克霍尔德菌K56-2的协同效应。结果以化合物存在下的生长抑制百分比表示，相对于无化合物时（无论是单独使用，x轴）或与PMB组合使用（y轴）。黑点代表每种化合物。红点代表所有未添加库化合物的孔的结果（每板一孔）。被认为单独显著抑制或与PMB协同的化合物必须抑制生长≥70%（虚线表示，阴影区域代表更高抑制水平）。点线斜率为1并通过原点；仅用于说明目的。左上象限的点代表在测试浓度下不直接抑制洋葱伯克霍尔德菌生长但与PMB协同的化合物。右下象限的点代表抑制洋葱伯克霍尔德菌但被PMB拮抗的化合物。右上象限靠近线的点代表抑制洋葱伯克霍尔德菌但不增加或减少PMB效应的化合物。化合物为（A）IKD-8344、（B）新生霉素、（C）CL0231、（D）micacocidin B和（E）thielavin B。
在测试浓度（1μg/mL）下，无PMB时，2686种海洋来源化合物中无一对细菌细胞有显著抑制作用（图1）。无PMB时的最高抑制为22.8%。在这些条件下，该库化合物直接抑制洋葱伯克霍尔德菌菌株K56-2的命中率为0%（0/2686）。这并不排除它们在更高浓度下可能具有直接抗生素活性。如下所述，库中一种化合物是新生霉素，如果库浓度为20μg/mL，则会观察到无PMB时的细菌生长抑制。
筛选揭示了五种化合物能有效增强PMB对洋葱伯克霍尔德菌K56-2的抗微生物活性（图1）。它们各自与PMB的组合在20小时时相对于单独PMB的生长抑制≥70%。与PMB协同的化合物命中率为0.2%（5/2686）。这些化合物是thielavin B（图2A）、micacocidin B（图2B）、IKD-8344（图2C）、一种新化合物CL0231（图2D）和新生霉素（图2F）。库中存在三种与micacocidin B结构相似但不与金属复合的化合物，但它们均无与PMB对洋葱伯克霍尔德菌的协同作用。这提供了一个内部对照，表明micacocidin B中的金属是其活性所必需的。一种与CL0231相似的化合物（CL0236；图2E）其中缬氨酸被苯丙氨酸取代，无与PMB的协同作用，表明CL0231及相关化合物的生物活性取决于其氨基酸序列。在这五种化合物中，新生霉素和IKD-8344的活性在后续研究中得到确认（确认率40%；2/5），因为我们无法获得其他三种化合物的足够量来重复assays。
图2.文中讨论的化合物的化学结构：（A）thielavin B；（B）micacocidin B；（C）IKD-8344；（D）CL0231；（E）CL0236；（F）新生霉素；和（G）氯新生霉素。结构使用Marvin Sketch v.14.12.8绘制。
3.2.新生霉素和多粘菌素B对其他伯克霍尔德菌分离株的协同作用
我们评估了新生霉素对洋葱伯克霍尔德菌K56-2的协同效应是否也发生在其他临床BCC分离株中，包括多重伯克霍尔德菌菌株C0514和两株妥布霉素耐药的BCC分离株（GIB-C1141144和GRI-C1210932）。除了测试PMB，还包括粘菌素和妥布霉素，因为这些抗生素的雾化制剂用于治疗CF患者的肺部细菌感染。我们首先确定了这些BCC菌株的个体MIC。它们所有的新生霉素MIC均为16μg/mL，远低于铜绿假单胞菌PAO1（512μg/mL）和大肠杆菌DH5a（128μg/mL）的值。BCC细菌在测试的最高浓度（1024μg/mL）下生长，用于PMB和粘菌素。最后，BCC分离株GIB-C1141144和GRI-C1210932对妥布霉素的耐药性显著高于K56-2或C0514（MIC分别为2048μg/mL和4096μg/mL）。
进行棋盘格assays以量化协同水平。由于所有BCC细菌对PMB和粘菌素的MIC大于测试的最高浓度（1024μg/mL），我们经验性地将1024μg/mL视为MIC的一半。新生霉素与PMB和粘菌素对测试的BCC菌株均表现出协同作用（表1）。新生霉素与AMPs对革兰氏阴性菌的协同作用先前已有报道。新生霉素略微增强了妥布霉素对K56-2和C0514的活性，但FICI大于0.5（表1）。相反，亚MIC浓度的妥布霉素拮抗了新生霉素对妥布霉素耐药分离株GIB-C1141144和GRI-C1210932的活性（FICI大于1）。我们推测亚MIC浓度的妥布霉素在这些菌株中激活了一种机制，提供对新生霉素的交叉耐药性。
由于我们目前无法从海洋来源提取更高浓度的这些化合物，且大多数化合物缺乏替代来源，无法对初始筛选检测到的其他协同化合物进行类似实验。这些化合物从其生产者生物发酵、从重组表达系统过量生产或化学合成是未来进一步评估这些化合物的可能选项。