讨论
对革兰氏阴性恶臭假单胞菌功能基因组学的研究揭示了细胞生理学基本概念的宝贵见解。恶臭假单胞菌属于能够利用多种有机化合物作为唯一碳源和氮源的微生物。其中许多已经获得了利用有毒和异生物质生长的能力。它们在消除污染水体和土壤中的有机废物方面发挥关键作用。
最近，这类微生物对尼古丁的降解因其在解毒烟草废物方面的巨大潜力而受到越来越多的关注（图7A、7B和7C），并进行了相关的细胞生长和静息细胞反应（图7和图8）。nicA1基因缺失突变体在尼古丁培养基中生长良好，与野生型S16菌株相同（图8A、8B和8C），而nicA2基因缺失突变体不能在尼古丁培养基中生长（图7和图8C）。删除nicA2而非nicA1阻止了尼古丁分解代谢，证明了新发现的NicA2的重要性。对NCBI数据库的同源性搜索显示，NicA2的氨基酸序列与节杆菌属尼古丁vorans的6-羟基-L-尼古丁氧化酶、节杆菌属尼古丁vorans的6-羟基-D-尼古丁氧化酶以及假单胞菌属菌株HZN6的尼古丁氧化酶的氨基酸序列分别具有23.6%、12.0%和82.0%的同一性。总的来说，这10个尼古丁诱导基因有助于清晰理解恶臭假单胞菌S16尼古丁降解中未知的分解代谢途径。对本研究产生的蛋白质组谱的比较分析揭示了广泛的细胞过程和功能，其中一些最深刻的表达变化发生在具有氨基酸转运、能量产生、细胞壁膜和包膜生物发生等功能作用的注释功能蛋白中，例如基因porin和mfs（表S2，图S1和图2）。该方案的成功应用导致了对恶臭假单胞菌对尼古丁全局反应的扩展和精炼。
在过去几年中，通过不同方法鉴定SP羟基化关键基因的努力均未成功。最终在本研究中，借助比较蛋白质组和遗传分析，新鉴定并表征了恶臭假单胞菌的spmA、B和C基因。这些基因编码3-琥珀酰吡啶单加氧酶，该酶将SP羟基化为HSP，作为尼古丁降解的一个步骤。Spm所有部分的氨基酸序列与各种原核含钼羟基化酶和真核黄嘌呤脱氢酶显示出显著的同源性。在重组恶臭假单胞菌S16dspm中实现了spmA、B和C基因的表达以及催化活性SP单加氧酶的形成。在含有重组质粒pET28a-spmABC的相应大肠杆菌BL21(DE3)中检测活性酶的尝试未成功，这一结果与先前研究恶臭假单胞菌86中参与喹啉降解的基因qorM、S和L的工作相似，也与节杆菌属尼古丁vorans中pAO1编码的尼古丁脱氢酶基因在尼古丁降解中的另一结果相似。
当Spm基因在大肠杆菌中表达时，可能导致形成缺乏钼蝶呤胞嘧啶二核苷酸辅因子(Mo-MCD)的无活性3-琥珀酰吡啶单加氧酶。在大肠杆菌中，辅因子是钼蝶呤鸟嘌呤二核苷酸(MGD)作为钼辅因子的有机部分，而其他细菌利用Mo-MCD辅因子。因此，无法将Mo-MCD辅因子整合到功能性脱辅基蛋白中。这解释了为什么我们在过去几年中使用其他几种方法（例如构建基因组文库、克隆基因和在大肠杆菌中表达）未能获得spm基因。上述观察表明，Spm是一种新型的含Mo-MCD的三亚基羟基化酶，参与假单胞菌属的尼古丁降解。据我们所知，假单胞菌属HZN6中的sirA2(243 bp)是唯一报道的与SP降解相关的基因。SirA2，80个氨基酸残基，是一种硫转移酶，是形成钼蝶呤辅因子和吡啶环功能性羟基化酶所必需的。然而，恶臭假单胞菌S16中的Spm负责将SP羟基化为HSP，并且Mo-MCD对恶臭假单胞菌S16中的Spm至关重要。我们目前的研究有助于阐明恶臭假单胞菌S16的整个尼古丁降解途径，并进一步理解假单胞菌中尼古丁代谢的分子水平机制。
所有这些机制见解可以扩展到假单胞菌对环境的适应，可能在生物降解、生物修复和生物催化剂方面产生影响。本文提供的2D LC/MS数据的可用性将允许更有针对性地搜索在特定细胞活动期间差异表达的蛋白质。检查蛋白质组和相应的转录数据是理解环境污染物和毒物分解代谢中涉及的分子变化的有用方法。
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