(ii)非热灭活实验
生成了一个新的包含96条非热灭活曲线的数据集，其中a_w是抑制因子，在所有可能的几种温度（12、16、21和25°C）、pH值（4、5和6）、a_w值（0.90和0.94）和乳酸浓度（5,000、10,000、20,000和45,000 ppm）组合下进行。TSB根据实验设计调节并在接种约10^8 CFU/ml的大肠杆菌O103:H25或大肠杆菌O157:H7前保持在目标温度。在适当的时间间隔，样品铺板于胰蛋白酶大豆琼脂（TSA;Oxoid）；平板在37°C培养48小时。选择延长的培养时间而不是传统的24小时，是因为37°C可能不是应激细菌恢复和后续菌落形成的最适温度。尽管有此预防措施，绝对菌落计数可能受到影响。然而，假设恢复环境对灭活过程所有采样时间的绝对计数具有相同影响，因此种群灭活速率的估计不应受恢复条件的显著影响。但这未经实验证明，可能是细菌灭活复杂性和缺乏线性的原因之一。
(iii)生长/无生长实验
生成了两个新的数据集。第一个数据集用于评估在288种条件下生长的能力，这些条件由几种温度（10、16和20°C）、pH值（4.8、5.1、5.4、5.7、6.0和6.3）、a_ws（0.94、0.95、0.96和0.97）和乳酸浓度（5,000、10,000、20,000和45,000 ppm）组合而成。TSB经调节并设定至目标温度。将225μl体积分装到Bioscreen微孔板中，并用25 ul 100倍稀释的大肠杆菌O103:H25接种。在第二个数据集中，评估了大肠杆菌在144种条件下生长的能力，这些条件由更宽的温度范围（10、16、20和25°C）和更高的a_ws（0.96和0.99）与第一个数据集相同的pH值和乳酸浓度组合而成。TSB按上述制备，并用25μl等量混合的100倍稀释的大肠杆菌O103:H25培养物和100倍稀释的大肠杆菌O157:H7 218培养物接种。
板边缘用250μl无菌TSB或225μl TSB接种25μl 100倍稀释的大肠杆菌填充，以跟踪TSB中的正常生长。在接种时以及随后每天在600 nm下进行光密度测量（Bioscreen C生长曲线分析仪），持续最多33天。将微孔板储存在塑料盒中以避免液体蒸发，并在目标温度下培养。每个菌株和环境条件组合至少记录两个重复。
(iv)在中试工厂制造FRMS
香肠生产在生物安全3级实验室中进行，如先前所述。使用的“挪威香肠”配方如下（每公斤克数）：牛肉378.5；猪肉378.5；猪背脂肪200；葡萄糖40；亚硝酸钠0.08；抗坏血酸0.5；香肠香料（商业预混料）3。按制造商说明添加LS-25 Starter培养物（Gewurzmiller,Germany）。切碎和混合后，在灌装到纤维肠衣（直径70 mm）制成约500至700克的香肠前，将约10^8 CFU/g的大肠杆菌O157:H7 218Rif与Starter培养物轻轻混合。为了覆盖所有采样（每次采样1根香肠），每批至少制作10根香肠。灌装时肉糜温度为-2至0°C。香肠在环境温湿度下调节约2小时，然后转移到气候室。气候室中的温度和相对湿度（RH）方案如下：24°C和94%RH下3天，18°C和85%RH下3天，17°C和81%RH下4天，以及15°C和75%RH下17天（表1）。通过自动温度记录装置（Termometerfabriken Viking AB,Eskilstuna,Sweden）监测香肠内部温度。对于上述方案的四个阶段，实际内部温度平均分别为24.2°C、18.6°C、17.0°C和14.2°C，偏差为±0.4°C。
代表典型“瑞典mettwurst”型香肠的肉糜直接从瑞典香肠工厂冷冻交付（未提供确切配方）。
如上述所述，在灌装和称重前，将大肠杆菌O157:H7 218Rif和Starter培养物（FSC 111;Chr.Hansen A/S,Denmark）混合到肉糜中。气候室中的温度和RH方案为：19至21°C和40至50%RH下24小时，22°C和70%RH下3天，20°C和60%RH下2天，以及16°C和60%RH下4天（表1）。实际内部温度平均分别为20°C、22.4°C、20.7°C和15.7°C±0.4°C。成品香肠真空包装并在4°C黑暗储存。
为了研究发酵温度和储存条件的影响，用约10^7 CFU/g等量混合的大肠杆菌O157:H7 218Rif和大肠杆菌O103:H25 Rif接种挪威香肠。温度方案为24°C或34°C下3天，18°C下3天，17°C下7天，以及15°C下7天（表1）。成品真空包装并在不同温度（12、16、21或25°C）下储存最多66天（表1）。
在适当的采样时间，取出一整根香肠；将10克香肠中段与90毫升0.4%蛋白水在拍击式均质器中混合。使用Aqualab仪器（Decagon Devices,Pullman,WA）根据制造商说明分析水分活度。在拍击式均质器的水相中测量pH值。乳酸浓度由商业分析实验室（Eurofins Norge,Moss,Norway）测定。样品铺板于含有100μg/ml利福平（Sigma-Aldrich,Norway）的TSA平板（Oxoid）上。
(v)参数估计
需要时，通过将Baranyi和Roberts模型拟合生长曲线来估计最大比生长速率，而热和非热比灭活速率则从灭活曲线线性部分的斜率估计，该曲线表示为浓度自然对数对时间的关系。
在温度大于约47°C时，温度本身对大肠杆菌表现出致死效应，并且温度对大肠杆菌灭活的影响发生急剧变化，这需要开发热灭活模型。因此，开发了一个热灭活模型来描述温度对大肠杆菌的致死效应。为此，将ComBase中报告的49°C至55°C温度范围和pH 7下测量的38个热灭活速率与萨拉米香肠在相同温度和pH下报告的结果进行了比较。在后者的研究中，在49至62°C之间的几种热处理下，大肠杆菌O157:H7在pH 4.4和4.8的pepperoni中的响应被量化。在pH 4.8的萨拉米香肠中观察到最大的耐热性。该数据集用于拟合热灭活模型参数（表2）。
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