3讨论与结论
昆虫病原线虫进入昆虫体内后，将其携带的共生细菌释放于寄主昆虫的血淋巴中，共生细菌迅速繁殖产生杀虫毒素，昆虫病原线虫自身分泌的毒素结合共生细菌产生的活性物质分解寄主昆虫组织，使寄主昆虫在短时间内患败血症死亡(王大业，2020)。目前已经有对昆虫病原线虫共生细菌的杀虫蛋白和共生菌代谢产物开发的研究，结果表明，共生细菌具有杀虫活性主要是其代谢产物中的血腔活性物质起作用(彭刘亮，2017)，包括抑菌活性物质(黄武仁等，2005;Fangetal.，2011;Binda-Rossettietal.，2016)、杀虫毒素(Bowenetal.，1998;Sheetsetal.，2011;Yangetal.，2012)、抗癌活性物质(Paiketal.，2001)等，在目前的相关研究中，昆虫病原线虫共生细菌常被用作生物制剂应用于害虫生物防治及生态环保领域。
本研究结果表明，共生细菌作为昆虫病原线虫在寄主昆虫体内生长繁殖的重要介体，其生长发育可以受胰岛素的调控，共生细菌可以直接吸收利用胰岛素。本研究结果将在利用昆虫病原线虫共生细菌及其代谢产物提高对害虫的致病力方面提供新思路(吴文丹等，2014;王杰等，2021)，而对于共生细菌的具体杀虫机制以及能否利用胰岛素提高共生细菌代谢产物活性，尤其是血腔活性物质的活性，进而改善昆虫病原线虫共生细菌的杀虫效果等问题还尚不明确，这也将成为未来新的研究方向。
本研究结果表明，一定浓度胰岛素处理会促进共生细菌伯氏致病杆菌0657L菌落的生长(图1，2)，不同浓度的胰岛素对伯氏致病杆菌0657L生长速率的提高程度不同，低浓度胰岛素(1∶5 000)较高浓度胰岛素处理(1∶500)生长快(图3)。
而有趣的是，高浓度胰岛素(1∶500)处理的伯氏致病杆菌0657L饲喂的卡森斯氏线虫0657L运动和吞咽能力均强于低浓度胰岛素(1∶5 000)处理的伯氏致病杆菌0657L饲喂的卡森斯氏线虫0657L(图5，6)。在实验数据上表现为促进共生细菌生长速率加快的最佳浓度为1∶5 000，而促进线虫行为学能力增强的最佳浓度是1∶500。这表明，胰岛素对卡森斯氏线虫0657L生长发育及其体内分离出的共生细菌伯氏致病杆菌0657L的生长都有影响，但可能因为细菌和线虫的生长繁殖方式不同，对胰岛素的吸收和利用的方式也不同，因此共生细菌在形态学上表现出低浓度胰岛素处理下直径更大，而被取食后，仍然为高浓度更有利于线虫抵抗运动和吞咽能力衰退，这就与营养成分利用有关，具体机理还有待进一步考究。
胰岛素作为一种内分泌激素，与细胞生长、寿命、营养、生殖有关，还可促进蛋白质合成及脂肪储存，防止脂肪分解等。胰岛素在机体中的功能表现在多个方面，涉及受体结合，信号传导系统和缺陷的纠正等，进食和禁食期间能量的储存和释放，基本由胰岛素调控，是生物体生存的重要方面(Mayeretal.，2007;顾世红和陈建国，2009;Thevisetal.，2010)。胰岛素、胰岛素样生长因子(insulin growth factor，IGF)和胰岛素样肽(insulin-like peptide，ILP)通常与维持葡萄糖稳态有关，当机体内胰岛素分泌不足时，来自食物的糖分就只流动在血液中，无法进入细胞为机体所用，此时胰岛素的补充能够帮助食物中的糖分顺利进入机体内各组织细胞以提供能量(顾世红和陈建国，2009)，这种功能在昆虫(果蝇)和秀丽隐杆线虫中是保守的(Thevisetal.，2010;Graham and Pick，2017)，此外，胰岛素在代谢、生长、繁殖、成虫健康和衰老方面也发挥着重要作用(Hafen，2004)。胰岛素信号通路是高度保守的衰老调控通路，包括Ins R/IRS-1通路和RAS/MAPK通路(Beale，2013)。其中IRS-1可通过PI3K/Akt通路起到促进胰岛素影响葡萄糖代谢与脂质代谢的作用，该通路中胰岛素受体同源蛋白daf-16受基因daf-2负调控(张思雨等，2022)。本研究发现，胰岛素处理在明显促进卡森斯氏线虫0657L共生细菌的生长的同时，有延长昆虫病原线虫寿命、抵御运动和吞咽能力衰退作用。这可以说明昆虫病原线虫作为共生细菌的携带者，能够通过胰岛素处理的特异性共生细菌间接地影响昆虫病原线虫体内新陈代谢信号的传导(共生细菌吸收胰岛素后长势更佳，为昆虫病原线虫提供稳定的生活环境和丰富的营养物质，其中蛋白质、脂类及少量糖类参与其体内细胞膜的组成，细胞膜完整保证了细胞的正常能量和物质交流)，从而起到抗衰老的作用，初步揭示了胰岛素在昆虫病原线虫及其共生细菌生长发育中的作用。
研究表明，寿命的延长通常是与饮食限制(dietary restriction，DR)和热量限制(caloric restriction，CR)有关的，且饮食限制诱导的寿命延长的其中一个关键通路是IIS(胰岛素/胰岛素样生长因子1)信号传导(Nässel and Vanden，2016)。在本研究中，吞咽试验为直接在线虫生长培养基上统计中食道球抽动次数，即线虫正常取食，说明并未造成饮食限制(即饥饿)，而已有报道线虫(秀丽隐杆线虫)可在多种不同饮食限制方案下主要通过激活LET-363/mTOR和IIS两个营养物传感途径延长寿命(Greer and Brunet，2009)，结合上述证据，可推断胰岛素能够延长昆虫病原线虫的寿命，且排除胰岛素对卡森斯氏线虫0657L寿命的延长作用是由饮食限制引起的可能性，这与人类医学模式生物秀丽隐杆线虫C.elegans的寿命研究结果并不完全吻合。鉴于本研究中线虫摄食正常但最终得到寿命延长的结论，初步猜想是某些酶通过IIS通路中的靶标基因(如UTX-1)调控寿命(Greer and Brunet，2009)，共生细菌吸收胰岛素后为卡森斯氏线虫0657L提供丰富的营养成分，线虫充分利用营养物质至体内蛋白(酶)合成达到平衡时，相应靶标基因所在的信号通路关闭，基因表达量降低，衰老相关细胞功能维持稳态，寿命得以延长。这也恰好说明，寿命不仅在遗传水平上被调控，而且与新陈代谢调节和营养物质也密切相关。
研究使用胰岛素处理的共生细菌培养卡森斯氏线虫0657L，发现线虫生长早期，头部摆动次数和吞咽次数均较慢，生命中期，其头部摆动频率和咽泵吞咽频率均提高，直到生命后期又有一定程度的下降，说明线虫的衰老随着生命过程而发生，主要体现在运动和吞咽能力上。运动和吞咽与肌肉功能息息相关(Dall and Færgeman，2019;刘嘉榆，2022)，3个不同生长阶段中的胰岛素处理组运动和吞咽能力均较对照组强，表明胰岛素可以提高线虫的肌肉功能，起到有效抵抗衰老的作用。
综上所述，胰岛素的补充可以促进昆虫病原线虫共生细菌的生长，能够延长昆虫病原线虫的平均寿命并提高运动和吞咽能力。本研究仅证实了胰岛素在线虫生物学特征方面的作用，为昆虫病原线虫的制剂化提供了新的思路，也为昆虫病原线虫在生物防治领域的进一步高效开发利用提供了理论基础。为明确其作为调控机体代谢的重要物质在表观遗传学上是否也具有类似的作用，具体的作用机制如何，还需通过分子生物学技术手段的进一步探究。
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