讨论
从ORR S-3池塘延伸的污染羽流代表了一个极端的人为污染环境例子。该站点提供了一个独特的机会研究高浓度硝酸盐和多种金属对微生物群落的影响。例如，使用三维电阻率断层扫描测量估计ORR站点主要含硝酸盐羽流中硝酸盐浓度高达50 g/升，并且从羽流内污染井直接化学分析显示硝酸盐浓度高达11.6 g/升（190 mM）。相比之下，其他污染环境中的硝酸盐浓度约低两个数量级。这些包括受农业肥料实践影响的Chesterville Branch Watershed,MD（10 mg/升），以及伊朗设拉子市下的Shiraz冲积含水层，高度污染硝酸盐来自农业和工业活动，硝酸盐浓度高达149 mg/升。美国环境保护署（EPA）对饮用水中硝酸盐的最大污染水平（MCL）为10 mg/升。
类似地，在混合物金属污染方面，ORR站点在金属数量
同样地，在金属混合物污染方面，ORR场地在金属数量和浓度方面具有独特性。例如，对S-3池塘附近受污染井的直接化学分析显示，许多金属的浓度升高，包括铝（560毫克/升）、锰（170毫克/升）、铀（140毫克/升）、镍（9.4毫克/升）、钴（1.8毫克/升）、镉（1.1毫克/升）、铜（0.95毫克/升）和铁（0.55毫克/升）（12）。与其他受污染场地的比较较为困难，因为数据通常
可用于排放到环境中的废水。例如，不锈钢酸洗产生的冶金废水含有更高浓度的铁（133.2毫克/升）和镍（30.3毫克/升），但这些数值是在排放到环境之前（23）。同样，在酸性矿山排水（AMD）场地，如肯塔基州的派克维尔AMD场地，排放到当地溪流前的废水中铁的浓度（2.88毫克/升）高于ORR羽流中的浓度，但其他金属如锰（1.25毫克/升）和铝（0.641毫克/升）的浓度则低得多（28）。在田纳西州的寡妇溪AMD场地，进水中的铁浓度（474毫克/升）远高于ORR场地，但锰（9.4毫克/升）、铝（1.8毫克/升）和镉（0.04毫克/升）的水平则低得多（29）。华盛顿州的米德内特矿山是一个已关闭的露天铀矿，水样中锰（143毫克/升）和钴（1.6毫克/升）的水平与ORR相似，但铀（24毫克/升）、镍（2.7毫克/升）、铜（0.18毫克/升）、铁（0.18毫克/升）和镉（0.05毫克/升）的浓度较低（30）。从德国约翰格奥尔根施塔特的铀废料堆中采集的沉积物样本中，铁（760毫克/升）和铜（6.6毫克/升）的浓度高于ORR，但铝（680毫克/升）、镍（5.0毫克/升）和钴（2.4毫克/升）的浓度相似，锰（50毫克/升）和铀（3.0毫克/升）的浓度较低。
本研究中鉴定的七种耐金属菌株均从ORR地下水或沉积物中分离获得，所用富集物模拟了污染环境中的金属浓度。需要强调的是，不同金属可划分为不同类别，且其化学性质差异显著。例如，大多数金属以可溶性二价阳离子形式存在于中性酸性pH的地下水中，包括Cu2、Cd2、Fe2、Co2、Ni2和Mn2。相比之下，部分金属如Al3和Fe3为三价阳离子，在中性pH条件下形成不溶性氢氧化物，且在pH低于5.5和3.0的地下水中大多可溶。进一步对比显示，铀以可溶性氧阳离子二氧化铀2形式存在，而铬则以可溶性氧阴离子铬酸盐2形式存在。表3展示了这七种新菌株对不同金属的敏感性，其中金属按化学性质分组。在二价阳离子中，所有菌株的EC50值普遍相似，抗性按Cu、Cd、Co、Ni、Mn顺序递增。对于氧阳离子二氧化铀2，除Castellaniella sp.菌株MT123外，其他菌株均表现出高度抗性，但氧阴离子铬酸盐2的EC50值范围较大。有趣的是，MT123对氧阳离子（二氧化铀2）和氧阴离子（铬酸盐2）高度敏感，但对毒性更强的二价阳离子Cu2和Cd2的耐受性优于大多数其他菌株。进行金属抗性生长研究时，MT123的最佳生长pH低于其他菌株（pH 5.5对比pH 6.0至7.0）。在复杂有机介质中，由于形成不同磷酸盐、硫酸盐和氢氧化物离子时的形态变化，铀和铬的毒性会随pH值大幅波动。
其中五株菌株来源于受污染的地下水，但另外两株——Pantoea sp.菌株MT058和Serratia sp.菌株MT049——分别从未受污染的沉积物和地下水中分离获得，这表明硝酸盐和金属抗性菌株存在于未受污染的环境中。有趣的是，其中一株菌株MT058对COMM的抗性排名第二（EC50值为0.7）。MT058的ESV不仅在多个未受污染的水井中发现，还在四个含有超过5 M铀的受污染水井中发现，其中一井含有50 M铀。
事实上，我们分离出的七株菌株中有四株（MT049、MT058、MT094和MT0123）的ESV在多个ORR水井中被发现，且所有四株菌株均存在于未受污染的水井和至少一个含有超过15 M铀的受污染水井中。因此，即使从未受污染的环境样本开始，本研究中用于在环境相关金属浓度下富集金属抗性细菌的方法也取得了成功。金属抗性菌株生长的pH范围较广，这与产生ESV匹配的水井pH值相吻合（图4A）。例如，MT123的pH最适值为5.5，在pH为5.2的地下水井（FW104）中占ESV匹配的7%。同一菌株（MT123）也在其他水井中以较低水平存在。
pH值范围在3.4至9.8之间。另一方面，两种Paenibacillus sp.菌株（MT086和MT124）在ORR地下水调查中未发现任何ESV匹配。由于Paenibacillus属物种是产孢生物，其DNA可能未在16S rRNA基因序列数据中被检测到。此外，这两种菌株是从FW126井中分离的，该井的pH值（3.0）为所有ORR污染井中最低之一，且硝酸盐和金属浓度最高（表1）。尽管先前在ORR污染沉积物中已通过16S rRNA基因序列检测到多种Paenibacillus属物种（34），但此类条件可能促进孢子形成和/或使地下水样本的DNA提取复杂化。
未来在ORR进行的地下水16S rRNA调查可受益于使用内部孢子对照来确定从高度可变的地下水基质中提取DNA的效率。本研究的独特之处在于，它研究了ORR中的硝酸盐还原与多金属抗性相结合，而非仅关注单一种或少量金属的硝酸盐还原或抗性。一项综述研究了ORR中硝酸盐还原菌，并结合了24项不同研究的微生物群落数据。该综述确定了32个潜在的硝酸盐还原属，这些属与本研究的分离株有显著重叠。
事实上，在研究中通过逆转录总RNA扩增来特异性观察ORR（25,35,36）处的活性微生物群落时，鉴定出了硝酸盐还原菌卡斯特拉尼埃拉和潘尼芽孢杆菌。在对硝酸盐污染井进行乙醇生物刺激实验时，还鉴定出一种卡斯特拉尼埃拉菌，这可能对ORR（37）处的原位硝酸盐去除具有重要意义。从ORR处污染沉积物中分离出的几种芽孢杆菌和其他物种随后被筛选出对铅、汞、铬、镉和铀的抗性。然而，本研究与当前研究的不同之处在于，这些菌株未在硝酸盐还原条件下进行表征，且富集过程未在反映污染环境的金属浓度下进行。
在我们的研究中，从ORR环境中分离出七种新的菌株，这些菌株能够在多种金属（包括铝、锰、铁、钴、镍、铜、镉和铀）存在的情况下，通过还原硝酸盐获取生长所需的能量，这些金属的浓度接近于ORR污染现场的水平。事实上，当这七株分离菌在有或没有COMM金属混合物的条件下培养时，其硝酸盐还原速率相似（图3）。已知高浓度的多种金属离子会破坏氧化还原酶类酶（如硝酸盐还原酶）和呼吸途径（如反硝化作用）。例如，在一项关于盐沼沉积物中反硝化速率的研究中，报告指出初始反硝化速率受到几种金属（包括铅、镍、铬、锌、铜、铁和镉）在1克/升浓度下的抑制（24）。同样地，对模型反硝化生物——假单胞菌RCH2在反硝化条件下进行的全基因组适应性测定显示，当在高浓度的几种不同金属（包括铜、锌、铬和铀）存在时，硝酸盐还原酶和反硝化相关基因的破坏会导致该生物在高浓度金属存在下的适应性下降（39,40）。因此，我们分离出的ORR生物体必定具有分子和物理层面的金属抗性机制，使它们能够在极端的ORR环境中生存，而这些机制的性质目前仍在研究中。
总体而言，S-3池塘周围受硝酸盐和金属污染的ORR站点是一个极端环境，我们从中分离出七种新的硝酸盐还原细菌，这些菌株能够单独且同时耐受多种金属的组合，包括二价阳离子、三价阳离子、氧阳离子和氧阴离子。这些菌株在pH最适值、生长pH范围、碳源偏好和金属耐受程度方面表现出多样性。其中几种菌株还通过16S rRNA基因序列在多种ORR未污染和污染井中被检测到。然而，所有菌株在环境相关浓度的多种金属存在下生长时，均保持硝酸盐还原酶活性。未来对这些菌株所含金属耐受分子机制的研究可能揭示独特性质，进一步增进我们对其他硝酸盐和金属污染站点中微生物群落的理解。
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