1.2 实验方法
1.2.1 形态学研究
1)用接种环蘸取少量菌液于MRS固体培养基上划线，将平板放在25℃培养箱中培养1~2 d后，对菌落形态进行观察。
2)用接种环在纯化后的菌落培养基上挑取少量细菌至载玻片上，在其上方滴加少量清水，并用接种环将细菌均匀散开后把载玻片放至火焰上方烘干固定，再滴加1滴香柏油，用低倍镜寻找视野，再用高倍镜观察，最后使用油镜观察生物形态并拍照。
1.2.2 革兰氏染色实验
滴加少量菌液于载玻片上，将涂片置于火焰上方烘干固定，滴加结晶紫染液，处理1 min后用蒸馏水冲洗，滴加革兰氏碘液，作用1 min后冲洗，滴加95%脱色酒精，作用约35 s，直至载玻片上无紫色残留后立即水洗，最后滴加沙黄复染液染色1 min、水洗、烘干，先用低倍镜、再用40倍镜进行观察。
1.2.3 系统进化树的构建
本文将16S rDNA、dnaA、atpA、pheS 基因片段测序得到的基因序列与NCBI数据库进行比对，选取同种部分菌属序列进行下载，使用分子进化遗传分析软件MEGA 7.0，采用Neighbor-Joining法自举1000次构建亲缘进化树。
1.2.4 生长及产酸能力测定
将W. cibaria BWL4以1%接种量分别接种于30根装有4 mL的MRS液体培养基的试管中，28℃摇床中恒温培养，分别在2、4、6、8、12、16、24、36、48 h后任意抽取其中3管，以3根空白培养基为对照，测定A₆₀₀及对应菌液的pH值，以培养时间为横坐标，吸光度和pH值变化为纵坐标分别绘制生长曲线和产酸曲线。
1.2.5 耐酸、耐胆盐性能测定
1)耐酸性能的测定。用6 mol/L的盐酸滴加在3根含13 mL的MRS液体培养基的试管中，分别调节pH值至4.0、3.0、2.5，充分混匀后，分别将不同pH值的培养基各自分装至3根试管中。将菌液以1%的接种量分别接种至所有培养基中，28℃摇床恒温培养24 h，以未调节pH值的培养基为对照组，测各种菌液于600 nm处的吸光度。
2)耐胆盐性能的测定。与上述耐酸性能测定方法相似，以1%的接种量将活化的菌液接种至牛胆盐体积分数分别为0、0.1%、0.2%、0.3%的液体培养基中，恒温条件下28℃培养24 h，以未加牛胆盐的MRS培养基为对照组，测各组菌液于600 nm处的吸光度。
1.2.6 抗真菌谱测定
本实验采用平板对峙法，以灰霉菌、镰刀菌、扩展青霉、黄曲霉为病原菌，将保存于冻存管中的真菌菌块接种于PDA培养基上，25℃培养箱培养7~10 d，此时真菌已长至满盘，取无菌打孔器在靠近平板边缘位置取直径5 mm的霉菌菌饼，用镊子将菌饼接种到新的PDA培养基上，25℃培养12~24 h；用移液枪吸取10 μL活化2代后的W. cibaria BWL4菌液在距离菌饼4 cm处划线，25℃恒温培养3 d后观察抑菌效果。
1.2.7 抑细菌谱测定
以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、丙二酸盐克罗诺362为指示菌，以LB肉汤作为指示菌培养基，将活化1代后的指示菌以1%的接种量继续在37℃摇床中恒温培养至A₆₀₀值为0.8左右。
将候选菌株以1%的接种量接种于MRS肉汤中，28℃摇床恒温培养36~48 h，取8 mL菌液8000 r/min离心3 min，保留上清液，并用无菌的0.22 μm的水系滤头过滤，将滤后的上清液分成2份，一份不变，另一份调pH值为7.0。配置0.75%~1.00%的LB半固体培养基和1.5%~2.0%的素琼脂培养基并灭菌，将10 mL左右素琼脂培养基倒至平板上；待其完全凝固后用烧过的镊子取3个灭过菌的牛津杯放置培养基上，将指示菌以3%的接种量接种于温度为50℃的LB半固体培养基中，充分混匀，缓慢倒入培养基直至厚度达到牛津杯的1/3~1/2；待培养基完全凝固后用镊子取出牛津杯，向3个孔中分别加入150 μL上清原液、pH值为7.0的上清液和MRS肉汤；将平板缓慢平放于25℃恒温培养基中培养约18 h后观察抑菌圈大小，拍照并用游标卡尺测量抑菌圈直径。