Weiss和John报告了在孔底固定了荧光染料的标准96孔MTPs。由于这些所谓的“光极”对pH或DOT敏感，它们在一次实验中一次只能检测一个测量参数。这些板可以用标准微孔板读数仪读取，但仍存在上述同样的缺点。特别是DOT测量会受到摇动中断的阻碍。目前相同的传感器也可用于24孔MTPs。为了读取这些光极，可以使用PreSens公司的SensorDish Reader。该系统安装在摇床上，可以在不中断摇动过程的情况下提供实时的在线数据。据报道，在400 μL的填充体积下，kLa值高达250 1/h。在更高的填充体积（例如1 mL）下，这更适合光极测量，因为液体持续与光极接触，kLa值降至100 1/h。对于许多微生物细胞的发酵来说，这些传质条件可能存在氧限制。
Samorski等人引入了一种新的测量技术，该技术能够通过散射光、NADH、核黄素或荧光蛋白检测连续摇匀的微滴度板中的生物量浓度。这项技术首次提供了来自微生物反应器的关于生物量和产物形成动力学的实时在线数据，而无需干扰培养过程。
本文基于Samorski等人首次提出的技术，介绍了连续摇匀微滴度板在线监测技术的重大改进，并给出了几个可行应用示例。研究了通过散射光定量检测标准微生物表达系统（如细菌大肠杆菌和酵母多形汉逊酵母）的生物量浓度。此外，通过监测生物量和蛋白质形成（使用绿色荧光蛋白（GFP）作为模型蛋白）评估了不同培养基组成的影响。该技术进一步应用于菌株和培养基筛选、启动子表征以及操作条件评估。还研究了在发酵过程中使用可溶性荧光pH指示剂进行pH在线检测的应用。
方法
微生物和培养基
使用标准的微生物表达系统，细菌大肠杆菌和酵母多形汉逊酵母，来评估改进的测量装置。微生物由多个合作伙伴提供。菌株大肠杆菌BL21-Pet 28A ytvAC62A（表达一种基于黄素单核苷酸（FMN）的荧光蛋白（FbFP））由德国evocatal GmbH的Thorsten Eggger慷慨提供（FbFPs报告蛋白以evoglow®商品名销售，http://www.evocatal.com）。菌株多形汉逊酵母RB11-pC10-Mox-GFP和H.p.RB11-pC10-FMD-GFP分别表达由MOX和FMD启动子控制的GFP。它们由德国杜塞尔多夫海因里希-海涅大学微生物研究所的Carsten Amuel慷慨提供。对于生物量校准，使用了大肠杆菌JM109（ATCC 53323）和多形汉逊酵母野生型（ATCC 34438，同义词：Pichia angusta）的野生型菌株。
大肠杆菌实验使用三种不同类型的细菌培养基进行：复杂培养基Luria Bertani（LB）、Terrific Broth（TB）以及Wilms等人报道的用于大肠杆菌补料分批发酵的合成培养基（WR）。这些培养基的成分如下：LB培养基：10 g/L蛋白胨（Difco，来自美国Becton Dickinson），5 g/L酵母提取物（德国Roth），5 g/L NaCl，pH约6.7，未调节；TB培养基：5 g/L甘油（德国Merck），12 g/L蛋白胨，24 g/L酵母提取物，12.54 g/L K2HPO4，2.31 g/L KH2PO4，pH约7.2，未调节；WR培养基：2.0 g/L Na2SO4，2.68 g/L (NH4)2SO4，0.5 g/L NH4Cl，14.6 g/L K2HPO4，4.0 g/L Na2HPO4·2H2O，1.0 g/L (NH4)2-H-柠檬酸盐，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.01 g/L硫胺素，3 ml/L微量元素溶液（TES），20 g/L葡萄糖或甘油，用1 M NaOH将pH调节至7.2。TES包含：0.5 g/L CaCl2，0.18 g/L ZnSO4·7H2O，0.1 g/L MnSO4·H2O，10.05 g/L Na2-EDTA，8.35 g/L FeCl3，0.16 g/L CuSO4·5H2O，和0.18 g/L CoCl2·6H2O。用0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，德国Biomol）诱导大肠杆菌培养物。
为了用不同培养基研究多形汉逊酵母，应用了以下培养基：YPG，YPD，YNB-G，YNB-D（缓冲和非缓冲）。YP培养基包含：20 g/L蛋白胨（Difco，来自美国Becton Dickinson），10 g/L酵母提取物（德国Roth）和10 g/L甘油（YPG）或20 g/L葡萄糖（YPD），pH约7.6，未调节。YNB培养基包含：5 g/L (NH4)2SO4，1.7 g/L YNB（无硫酸铵和氨基酸，Difco，来自美国Becton Dickinson），和10 g/L甘油（YNB-G）或20 g/L葡萄糖（YNB-D）。所有培养基组分溶解后，用1 M NaOH将pH调节至6.0。缓冲的YNB培养基补充了0.1 M浓度的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液，以在分批发酵期间将pH维持在约6（起始值pH=6.0）。在不同甘油浓度的实验中，仅在培养基制备过程中改变YNB培养基中的甘油浓度，而其他组分保持恒定。除非另有说明，所有使用的化学品均为分析级，由德国Fluka（Neu-Ulm）提供。
测量装置
作为测量装置，应用了与Samorski等人先前报告的相同的装置，仅进行了少量但对信号质量有影响的更改。主要变化是改变了光纤与微滴度板底部之间的距离以及倾斜角。光纤到微滴度板底部的距离从7毫米减少到4毫米，倾斜角从23度增加到35度。这种调整主要减少了孔内内部反射产生的光的背向散射，从而稳定了测量信号。此外，将每次测量过程中氙闪光灯的闪光次数从200次减少到50次，以改善灯的寿命。生物量浓度通过在620 nm激发下（无发射滤光片）测量散射光来测量。GFP浓度通过485 nm的激发滤光片和520 nm的发射滤光片监测。此外，通过340 nm激发和460 nm发射监测NADH。FbFP首选460 nm激发和520 nm发射。光电倍增管的灵敏度（增益）适应了不同的测量任务，因此获得了不同的信号强度。为便于引用，整个装置在下文中被称为“BioLector”。当在微滴度板上用相同培养基培养相同克隆时，BioLector的数据重现性标准差小于5%。由于标准差小且信息含量高，图中的误差线被省略。
通过向TB培养基中加入HPTS（8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐，部件号：56360，德国Fluka）的无菌溶液，并在接种细胞前加入，来测量pH。在发酵培养基中，可溶性荧光pH指示剂以20 mg/L的终浓度使用。该指示剂通过波长为410 nm和460 nm的过滤氙灯激发，并对两种激发波长在510 nm处检测发射。pH值可以通过用缓冲液校准得出，在缓冲液中加入与培养基中相同浓度（20 mg/L）的HPTS。使用pH 4.0至9.0、离子强度为120 mM（20 mM缓冲液和100 mM NaCl）的缓冲液来校准测量装置。对于每种缓冲液条件，强度比IR计算如下：
IR = Iem 510 nm, ex 460 nm / Iem 510 nm, ex 410 nm (1)
确定不同缓冲液的IR后，使用玻尔兹曼方程将pH值关联如下：
pH = pH0 + dpH · ln((IR, min - IR) / (IR - IR, max)) (2)
校准参数pH0、dpH、IR, min和IR, max通过使用Excel表格及其内置Solver函数计算，确定函数（2）的最小平方根。
实验完全使用德国Greiner Bio-One的具有光学底部的黑色标准圆形96孔微滴度板（μ clear，部件号：655087）进行，并用英国Abgene的气体渗透膜（部件号：AB-0718）覆盖。除非另有规定，实验在200 μL培养物或培养基工作体积，通常995 rpm摇动频率（3 mm摇动直径）下进行。在此操作条件下，kLa值达到150 1/h。