长期以来，饲用抗生素在保障动物健康、促进动物生长、提高饲料利用率等方面取得明显的效果，给畜禽生产带来巨大的经济效益。但是也带来一系列问题，如耐药性、药物残留量和肠道内菌群混乱等，受到社会的重视。我国畜禽源病大肠杆菌在耐药率、耐药水平上均显著高于其它国家，已成为耐药性最为严重的国家之一[1]。并且出现多重耐药性的问题，继续滥用抗生素只会使耐药率不断提高。目前，欧盟多个国家均禁止使用饲用抗生素，中国对饲用抗生素的管理与应用也更加严格，所以，开发代替抗生素的绿色饲料添加剂成为当今研究的热点。而丁酸自从被列入《添加剂品种目录》后，渐渐被人们认知，大量学者开始对丁酸进行研究。
在饲料行业中，丁酸作为一种生物调节剂，可替代部分抗生素，起到酸化、电解质平衡调节、胃肠道微生态平衡调节、诱食等作用[2]。目前对丁酸的抑菌情况、作为添加剂及其添加剂量的报道相对较少，本试验通过测定丁酸对大肠杆菌生长曲线的影响，检测丁酸能否抑制大肠杆菌的生长，以醋酸对大肠杆菌生长曲线的影响作为对照，为丁酸代替饲用抗生素的研究提供一些依据。
1、材料与方法
1.1试验材料纯丁酸，由龙岩新奥生物科技有限公司赠送；MH琼脂培养基、LB肉汤、麦康凯琼脂，均购自广东环凯微生物科技有限公司；醋酸、大肠杆菌ATCC 25922、蒸馏水等。
1.2大肠杆菌ATCC 25922的复活在超净台内操作，将大肠杆菌ATCC 25922冻干菌株启封后，用接种环蘸取少量菌种到麦康凯培养基中，待菌种溶解后分区进行涂划得到单菌落，放入隔水式恒温培养箱中倒置过夜培养。在麦康凯平板上挑选一个大肠杆菌ATCC 25922单菌落，接种到装有3 mL LB肉汤的试管中，放入37℃恒温培养振荡器中培养4~6 h，长到生长对数期最佳。
1.3药液的配制先用纯丁酸、醋酸制备4%丁酸、醋酸母液。分别吸取4%丁酸、醋酸40μL加入到EP管中，再加入960μL高压过的蒸馏水，混匀后吸500μL到下一个EP管中，加入500μL蒸馏水混匀，以此类推，得到浓度为4%、2%、1%、0.5%、0.25%和0.125%的丁酸和醋酸。
1.4抑菌试验
1.4.1牛津杯试验将牛津杯等试验用具高压灭菌，放入电热恒温烘干箱烘干备用，在超净台内将已灭菌的牛津杯置于培养皿中，每个培养皿中放置4个。MH琼脂培养基温度降到50℃时，将MH琼脂培养基倒入烧杯中，加入200μL菌液（1 000倍稀释），混匀后倒板，每个板约20 mL。培养基凝固后，小心取出牛津杯，最后把浓度为4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%的丁酸、醋酸加100μL到对应的牛津杯孔中，每个浓度制作一个平行。静置2 h后，培养皿在37℃隔水式恒温培养箱中正放培养8~12 h，培养好后观察测量不同浓度丁酸、醋酸的抑菌圈。
1.4.2大肠杆菌OD值测定取不同量丁酸和醋酸加入LB肉汤中，配成浓度为0.1%、0.075%、0.05%、0.025%的LB肉汤，另做空白对照组。在每瓶LB肉汤中加入50μL大肠杆菌菌液(1 000倍稀释），混匀后吸取1.5 mL到24孔包被板中，每个浓度做一个平行，全部加完后把24孔包被板放入全自动多功能酶标仪测量OD值，测完后立即放入37℃恒温培养振荡器中进行培养。每隔1 h使用全自动多功能酶标仪测量OD值，24 h后对所有结果进行统计分析，并绘制成图。
2、结果与分析
2.1不同浓度丁酸、醋酸的抑菌圈将浓度为4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%的丁酸、醋酸加入到牛津杯制作出来的孔中，正置培养后测量抑菌圈直径（见图1、表1）。浓度为4%、2%、1%和0.5%的丁酸、醋酸对大肠杆菌均有抑菌作用，其中4%丁酸、醋酸的抑菌效果最好，抑菌圈直径分别达到22 mm、28 mm，其余未出现明显抑菌圈。抑菌圈直径随着丁酸、醋酸浓度升高而明显增大，相同浓度下醋酸的抑菌效果比丁酸好。
图1不同浓度丁酸和醋酸对大肠杆菌的抑菌圈
表1各浓度丁酸和醋酸对大肠杆菌的影响
2.2大肠杆菌的生长曲线图对浓度为0.1%、0.075%、0.05%、0.025%的丁酸和醋酸作用24 h的测量结果进行统计分析，绘制成图（见图2-图3）。0.1%丁酸组的大肠杆菌生长极其缓慢，OD值基本不变；0.075%丁酸组的大肠杆菌在19 h前生长缓慢，20 h开始轻微增长，最终OD值约达0.1；0.05%丁酸组的大肠杆菌生长明显被推迟，但是后期有明显增长，OD值接近对照组；0.025%丁酸组的OD值增长趋势与对照组相似，大肠杆菌生长没有受到明显抑制，最终OD值达约1.45。醋酸组与丁酸组结果相似，但在浓度为0.05%时有差距，醋酸组在该浓度没有出现明显对数生长期，且最终OD值约0.85，仅为对照组的一半左右。以上结果表明：丁酸、醋酸对大肠杆菌的生长均有抑制作用，且浓度越高，对大肠杆菌生长的影响越大。
图2丁酸作用下大肠杆菌的生长曲线
图3醋酸作用下大肠杆菌的生长曲线
3、讨论
本试验检测了丁酸、醋酸对大肠杆菌ATCC 25922的抑制效果。试验参考张含薇等[3]采用的牛津杯法，先把菌液加入MH琼脂培养基中混匀，再进行倒板，没有采用传统的先倒板再用涂布器涂布菌液，减少了涂布器涂布不均匀或者涂布过厚引起的误差。培养8~12 h后可以看到细菌分布均匀，浓度为4%、2%、1%和0.5%的丁酸、醋酸有明显的抑菌圈，由结果可知丁酸与醋酸一样对细菌都有一定的抑制作用，并且浓度越高抑菌效果越好。不同浓度丁酸的抑菌圈直径分别为4%（22 mm）、2%（18 mm）、1%（13 mm）、0.5%（9 mm），证实了丁酸对大肠杆菌的生长有抑制作用，且浓度越高抑制效果更佳。使用全自动多功能酶标仪对细菌菌液进行OD值测定，绘制生长曲线，结果表明丁酸和醋酸对大肠杆菌的生长曲线具有一定的影响，并且随着浓度的升高影响更明显，浓度为0.1%时影响最大，基本上抑制了大肠杆菌的生长。
短链脂肪酸主要有乙酸、丙酸和丁酸，本试验测定了丁酸、醋酸对大肠杆菌生长曲线的影响，发现丁酸和醋酸对大肠杆菌生长曲线均有影响，在牛津杯试验中也都产生明显的抑菌圈，同等浓度下醋酸的抑菌圈会稍微大些。在短链脂肪酸中丁酸起主要作用，丁酸既溶于水也溶于脂类，总体来说比较亲脂，在pH4~6的酸性环境下也很难被分解，所以，丁酸被动物摄入后可以避过小肠的酸性环境，进入动物的盲肠、结肠中继续发挥其重要作用。对肉鸡、仔猪的研究也表明，丁酸能够降低肠道pH，使肠道的环境变成适合乳酸菌等有益菌生长的酸性环境，添加酸化剂可以使动物肠道中乳酸杆菌的数量增加，降低大肠杆菌的数量，使肠道的微生物区系得到优化[4-5]。使用高脂饲料喂小鼠，结果显示丁酸钠可以使小鼠失调的肠道微生态得到恢复，从而减少脂肪肝的发生[6]。丁酸具有游离性和挥发性，因此，饲料生产中一般将丁酸制成稳定的钠盐-丁酸钠，丁酸钠的流动性较好，无污染、无残留，易与其它饲料混合，而且不会改变饲料的pH，将来在饲料工业上必能发挥更好的作用。
仔猪在断乳后的2 d内，回肠乳酸菌数量急剧下降，大肠杆菌数量明显增加，导致仔猪容易患大肠杆菌病。为了减少仔猪腹泻，常在断乳仔猪饲料中加入高剂量氧化锌，高锌饲料能够在早期断乳仔猪生长性能及防止腹泻方面起到显著的效果。张文丽[7]报道在仔猪饲料中加入高剂量氧化锌，能够在一定程度上促进仔猪的生长速度并提高仔猪的日采食量。王超[8]通过试验证实在生长早期仔猪饲料中添加高剂量锌可以促进仔猪的生长。但长期使用高锌饲料，会造成猪肉质量下降、猪肉中的锌残留量会过高。所以，在饲料行业中，很多研究者尝试用丁酸钠代替高剂量氧化锌，并取得一定效果。Manzanilla E G等[9]在早期断乳仔猪日粮中加入0.1%丁酸钠，可以大大降低腹泻率，尤其是断乳后7 d。大量研究表明，使用丁酸钠代替饲料中的高剂量氧化锌，能够大大降低断乳仔猪腹泻的发生，还可以增强断乳仔猪的抵抗力，提高断乳仔猪的采食量，促进断乳仔猪快速生长，提高断乳仔猪的健康水平。
4、结论
本试验表明，丁酸与醋酸类似，具有一定的抑菌效果，不同浓度产生的抑菌作用各不相同，药物浓度越高，影响越大。丁酸钠浓度达0.1%时，对大肠杆菌的生长曲线影响最大，大肠杆菌的生长基本受到抑制，因此，可以通过在饲料中添加丁酸钠达到抑制细菌的目的，为应用饲料添加剂抑制细菌提供参考。