2结果
2.1大肠杆菌噬菌体的分离鉴定
2.1.1噬菌体的分离及噬菌斑特征
尿液样品经过滤后的上清液与大肠杆菌K-12指示剂MC1061混合，通过双层琼脂平板法鉴定噬菌斑并纯化，37℃培养8 h，在平板上可见圆形、边缘光滑整齐的噬菌斑，中等大小且透明，如图1所示。
图1噬菌体vB_EcoS_JA2噬菌斑形态特征
2.1.2噬菌体的电镜观察
纯化的噬菌体经2%磷钨酸负染后，在透射电镜下所观察到的形态如图2所示。噬菌体vB_EcoS_JA2可见六角形头部，头部直径约40 nm，噬菌体含可收缩性尾部，宽约5 nm、长约110 nm。根据2012年国际病毒分类委员会第9次报告提出的噬菌体分类与命名标准，该噬菌体符合有尾噬菌体目（）、长尾噬菌体科（）特征。
图2噬菌体JA2电镜形态
2.1.3噬菌体核酸类型鉴定
经DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease处理后，将噬菌体基因组进行核酸电泳鉴定，结果显示，噬菌体JA2的基因组能被DNase I完全降解，而用RNase A处理不降解，表明其基因组核酸为DNA（图3）。同时Mung Bean Nuclease处理亦无法降解，表明该噬菌体基因组为双链DNA(dsDNA)。
图3噬菌体JA2核酸类型鉴定
2.1.4噬菌体的裂菌谱
通过平板裂解实验及点板实验（Spot Test Assay）检测噬菌体对不同细菌的裂解效果。结果发现，JA2对大肠杆菌K-12菌株MC1061，MG1655和DM1187具有极强的裂解效果，形成明显的裂菌圈，裂菌圈直径＞20 mm。同时发现该噬菌体对临床分离的UPEC菌株U892、U4208、U4228以及铜绿假单胞菌株U955也有较强的裂菌能力，对大肠杆菌O157菌株Min27，部分UPEC分离株，金黄色葡萄球菌，阴沟肠杆菌等没有明显的裂解效果（表1）。
表1噬菌体JA2裂菌谱
菌株类型菌株裂菌活性大肠杆菌K-12菌株E.coli K-12 strainMC1061+++MG1655+++DM1187+++UPEC分离株UPEC isolatesU892++U4208++U4228++U4261-U899-U3486-大肠杆菌O157菌株E.coli O157 isolateMin27-铜绿假单胞菌分离株P.aeruginosa isolateIsolates of enterobacter cloacaeStaphylococcus aureusU955+阴沟肠杆菌分离株Enterobacter cloacae isolateU547-金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus strainATCC43300-
表注：+++：极强裂解性；++：强裂解性；+：弱裂解性；-：不裂解.
2.2大肠杆菌噬菌体的生物学特性
2.2.1噬菌体的最佳感染复数
分别将噬菌体JA2与指示菌MC1061按照不同的比例混合，培养8 h后，测定培养上清中的噬菌体滴度（表2）。结果表明，当MOI=0.1时，培养后噬菌体滴度最高，表明0.1是该噬菌体的最佳感染复数。
表2噬菌体JA2最佳MOI测定
编号细菌数（CFU/mL）噬菌体数（PFU/mL）感染复数8h噬菌体滴度（PFU/mL）11×1091×1060.0012.50×108 21×1091×1070.016.34×1010 31×1091×1080.12.15×1012 41×1091×10914.45×1011 51×1081×109108.56×1010 61×1071×1091007.37×109
2.2.2噬菌体的一步生长曲线
如图4所示，噬菌体JA2感染宿主菌后10 min内噬菌体滴度没有明显变化，表明其潜伏期约为10 min，感染后20～60 min内噬菌体的滴度明显上升，之后趋于稳定，表明噬菌体裂解期约为60 min。根据裂解量（Burst Size）=爆发末期噬菌体效价（PFU/ml）/感染初期宿主菌浓度（CFU/mL）计算，噬菌体裂解量约为117 PFU/Cell，表明该噬菌体具有极强的裂解和复制能力。
图4噬菌体JA2的一步生长曲线
2.2.3噬菌体的热稳定性
噬菌体JA2在40～80℃水浴中分别作用30 min后的效价变化情况如图5所示。可以发现，随着温度升高，噬菌体效价开始明显下降，温度到达80℃时噬菌体基本失活。表明该噬菌体具有一定的耐热性，但高温容易引起其失活。
图5噬菌体JA2的热稳定性
2.2.4噬菌体的pH稳定性
在不同pH条件下培养1 h后，噬菌体在pH6.0～10.0范围能保持较高的活性，噬菌体滴度没有明显变化，且在pH为7时，噬菌体效价最高。随着pH值的升高或降低，噬菌体的滴度下降明显，在pH为2和13时，噬菌体完全失活（图6）。该结果表明该噬菌体能耐受弱酸和弱碱条件，具有较好的酸碱耐受性。
图6噬菌体JA2的pH稳定性
2.2.5噬菌体对氯仿的敏感性
将噬菌体JA2与分别与含1%，2%，5%氯仿的LB培养基混合，处理30 min后通过双层琼脂平板法检测噬菌体效价。结果显示，氯仿对噬菌体的滴度有较为明显的影响，随着氯仿浓度升高，噬菌体存活率相应降低（图7），提示该噬菌体对氯仿敏感。
图7噬菌体JA2对氯仿的敏感性
2.2.6噬菌体JA2对紫外线的敏感性
噬菌体经紫外照射后，按15 min为时间间隔取样，噬菌体滴度急剧下降，随着照射时间延长，噬菌体滴度下降幅度平缓（图8），表明该噬菌体对紫外线较为敏感，但也具有一定的抵抗能力。
图8噬菌体JA2对紫外线的敏感性
3讨论
本研究从临床尿路感染病例的尿液样品中分离得到了1株大肠杆菌噬菌体，根据其形态特征和生物学特性，将其命名为vB_EcoS_JA2，其中vB：viruses Bacteriophage（病毒噬菌体）；Eco：（大肠杆菌）；S：（长尾噬菌体科），JA2为分离噬菌体的编号。对噬菌体JA2的初步鉴定和生物学特性研究结果显示，该噬菌体在平板上形成的噬菌斑边缘整齐且清晰。噬菌体JA2对大肠杆菌K-12菌株、UPEC分离株具有明显的裂菌效果。噬菌体JA2在40～60℃具有较好的稳定性，对紫外线具有一定的抵抗力，其最佳感染复数为0.1。同时，该噬菌体一步生长曲线显示，其潜伏期约为10 min，爆发期约为60 min，裂解量约为124 PFU/Cell，表明JA2噬菌体具有极强的裂解和复制能力。
目前，大量的抗生素使用甚至滥用，这是导致耐药性细菌频发、“超级细菌”产生的元凶。广谱抗生素滥用导致的正常菌群损伤、细菌耐药性问题对公共卫生安全危害极大。耐药性细菌的出现，极大的增加了细菌感染性疾病，尤其是尿路致病性大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌感染的治疗难度。此外，UPEC临床菌株不断增强的抗生素耐药性，尤其是近来出现的对碳青霉烯类和粘菌素类抗生素的耐药性，使得UTI成为抗生素耐药的又一重灾区，迫切需要寻找新的治疗和预防手段加以防控。为此，探索不易引起耐药和残留的噬菌体抗菌治疗（Phage therapy）策略成为国内外研究热点。
裂解性噬菌体是特异性感染并杀灭细菌的病毒，其具有杀菌效率高、副作用少、宿主谱窄等特点，不会破坏机体正常菌群，在抗细菌感染中具有巨大潜力，因此在细菌耐药形势日益严峻的今日，开发噬菌体抗菌制剂已引发全球关注。2018年8月，上海噬菌体与耐药研究所噬菌体治疗团队成功完成了一例针对复杂性、反复性多重耐药肺炎克雷伯菌尿路感染患者的治疗，展示了噬菌体在治疗多重耐药菌感染、复发性尿路感染的强大潜力。本研究从尿液样品中分离的噬菌体JA2，UPEC临床分离株具有很好的裂解能力，且具有较好的稳定性，它是研究治疗耐药性细菌尿路感染的良好实验材料。
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