1.3.4 纤维素酶的测定
1.3.4.1 接种与培养
将固体曲培养料121℃、60min蒸汽灭菌，冷却至35℃左右,抢温接种待测菌株悬液。置30℃静止培养,每24h取样测纤维素酶活。
1.3.4.2 粗酶液的制备
称2.0g发酵曲,加蒸馏水20 mL，30℃水浴1h，每15min摇匀一次，3000r/min离心5min，取上清液为粗酶液。
1.3.4.3 纤维素酶活的检测
用3,5二硝基水杨酸(DNS)比色法，测定还原糖含量来确定FPA、CMC、C1三种纤维素酶活。
FPA滤纸酶活的测定：缓冲液2.0 mL,加入1× 6cm新华滤纸一张,50℃预热5min后加入0.5 mL酶液,50℃保温1h,取出加2.5 mLDNS试剂,煮沸5min,冷却后加水5 mL,540nm处测定还原糖。
CMC酶活的测定（内切葡聚糖酶）：2.0 mL含5% CMC的缓冲液,50℃预热5min后加0.5 mL酶液,其余操作同FPA酶活的测定。
C1酶活测定：2.0 mL缓冲液中加入50mg脱脂棉,50℃预热5min后加入0.5 mL酶液,50℃保温24h,其余操作同FPA酶活的测定。
酶活单位U:采用国际制单位,即在上述条件下，每分钟产生1μmol葡萄糖的酶量为一个单位。酶活力即扣除参比溶液中还原糖后,每毫升酶液中所含酶活单位的量。
1.3.5 菌株鉴定
参考《伯杰氏系统细菌学手册》、《真菌鉴定手册》进行鉴定。
1.3.6 复合菌剂在粪便堆积发酵中最佳生长条件的研究
以牛粪为实验对象，在实验室模拟条件下，将牛粪自然风干至含水量50%以下，去除大块杂质，磨碎待用，按L9(34)正交设计各因素水平用稻壳粉、2%麦饭石粉、水等调节物料的C/N比以及水分、pH值后，高温灭菌，置于中号医用搪瓷盘中，上覆塑料薄膜保水，28℃±1℃培养，培养2d后，进行翻堆，4d测定活菌数。每处理3次重复，均等取样混合测定各数值。活菌数的测定参见农业部微生物肥料标准NY884-2005进行。正交设计各因素水平见表1。
表1 复合菌剂在堆积发酵中最佳生长条件 L9(34)正交设计
2 结果与分析
2.1 纤维素分解菌菌种筛选及对滤纸、羧甲基纤维素分解能力的分析
对7种样品进行系统分离，初筛获得约20株菌，通过对菌落形态、生长速度的观察以及分解纤维素能力判定，挑选其中3株用PDA培养基平板进行分离纯化得到单个菌株B1、F1、F2。单个菌株B1、F1、F2以及它们相互混合对滤纸、羧甲基纤维素分解能力见表2、表3。从表2、表3可以看出：各菌株单独培养对滤纸、羧甲基纤维素均有一定的分解效果,但不如混合的效果好,B1、F1、F2混合培养8d时，滤纸失重率达到58.06%、酶相对活性0.93±0.00 cm·d-1，由此说明，3株菌株混合可以增加酶活力，各菌之间有很好的协同效应。
表2 不同培养时间的滤纸失重率/%
表3 不同菌株的纤维素酶相对活性及对滤纸的分解效果
2.2 纤维素分解菌酶活分析
结果见表4。从表4可见：B1、F1、F2菌株在固体曲中,都能很好地生长,随着培养时间的延长,酶活力提高，在培养5～6d时,酶活力达到最高。各菌株的FPA酶活力是B1F1F2＞B1＞F1＞F2；CMC酶是F1＞B1F1F2＞B1＞F2；C1酶是B1＞B1F1F2＞F1＞F2。各菌混合后FPA酶活力显著增加，与各菌对滤纸、羧甲基纤维素分解能力的试验结果相吻合，进一步了证明菌种间的协同增效作用。基于酶活力大小的比较及生产成本的考虑，选择B1、F1菌作为堆肥发酵的试验生产菌。
表4 不同菌株固体曲的纤维素酶活分析 单位:U/ml
2.3 菌株的鉴定
B1、F1菌株生长迅速，在察氏培养基上28℃培养7d，直径7～8cm，菌丝初期为白色，后期呈绿色，产孢丛束区摆列成同心轮纹，培养基背面成无色，培养基颜色不改变。分生孢子从菌丝的侧枝上生出，直立，分枝，小枝对生，顶端不膨大，上生分生孢子团，分生孢子球形，浅色或无色。F2菌株生长迅速，在察氏培养基上28℃培养7d，直径7～8cm，菌丝初期为白色，后期呈青绿色，培养基背面呈无色，培养基颜色不改变。营养菌丝有隔膜，分生孢子梗从菌丝垂直生出，孢梗顶端不膨大，分枝一次，顶端为小梗，分生孢子串成不分枝的链状，单个孢子球形，卵圆形，绿色。
根据各菌株的菌落特征和形态特征，按真菌分类鉴定手册和真菌分类学进行检索，初步认为B1、F1为木霉(Trichoderma),F2为青霉(Penicillium)。
2.4 复合菌剂在粪便堆积发酵中最佳生长条件的研究
以牛粪为研究对象，在实验室模拟条件下，采用L9(34)正交设计，研究物料水分、C/N、起始pH及接种量对复合微生物菌株生长的影响，结果见表5、表6。
表5 沼渣堆积发酵工艺条件的确定
表6 沼渣堆积发酵工艺条件正交试验方差分析（完全随机模型）
从表5、表6可以看出,对微生物生长的影响各因素按极差大小主次顺序为:B＞A＞D＞C，表明物料的C/N的比例对复合菌剂活菌数（生长）影响最大，物料pH影响最小。FB=38.29743＞F0.05=19,达显著水平，表明B因素影响显著，所以对该因素应控制在最优水平上,A、D、C因素对复合菌剂活菌数（生长）对结果影响不大。综合以上分析，得到最佳堆积发酵工艺条件A2B3C1D2，即物料C/N为35、水分60%、接种量5%、pH=8.0。在此工艺条件下，适合菌剂中的微生物 生 长 繁 殖 ，活 菌 数 达 到 40.12×108cfu/g。
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