摘要
生物膜通常是导致人类慢性感染和污染工业或医疗设备的原因。传统的方法是使用浓度越来越高的抗生素，但微生物会迅速对其产生多重耐药性。因此，我们研究了使用天然物质作为替代解决方案。使用配备图像分析软件的Cellavista自动显微镜测量基于定殖区域的生物膜定量。Cellavista设备的使用为固定细胞的鉴定和量化带来了新的可能性。在我们的研究中，通过探索两性霉素B、黄芩素、壳聚糖和松萝酸对酵母生物膜形成的抗真菌/抗生物膜活性，证实了这一特征。在96孔聚苯乙烯微滴度板上研究了这些物质对机会致病性假丝酵母和克鲁西假丝酵母生物膜形成和根除的影响。虽然两性霉素B不是很有效，但黄芩素和壳聚糖的使用，即使是在最低抑制浓度下，也能迅速减少井中的定殖面积。松萝酸即使在浓度为300μg ml时也没有显示出任何显着的抗生物膜特性−1、我们的研究结果表明，Cellavista是研究酵母生物膜形成和抗菌剂作用的一个很有前景的工具。
1、简介
生物膜是高度组织化的基质封闭微生物群落，它们不可逆地附着在表面、相界面或彼此之间。这些微生物群落经常污染医疗器械或工业设备，并引起广泛的人类感染。治疗这些感染的巨大问题是生物膜对常用抗生素的高度耐药性。生物膜中的微生物比浮游细胞更具抵抗力（高达1000倍）（Thebault等人，2013年）。
自然界中几乎99%的微生物能够以生物膜的形式生长，并在生物膜中定居在各种表面（Thebault et al.，2013）。细菌生物膜及其相关感染通常比其他微生物引起的生物膜得到更广泛的研究。然而，酵母生物膜，尤其是念珠菌属生物膜，也可导致人类严重感染（Trofa等人，2008年，Pires等人，2011年）。
念珠菌是医院感染或医疗器械上形成的生物膜中最常见的分离酵母菌之一。白色念珠菌通常被指定为最广泛的机会性致病酵母，但副Silosis念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和krusei念珠菌也成为许多研究中日益关注的主题（Kuhn et al.，2002，Gacser et al.，2007，Estivill et al.，2011）。C、副筒仓病可导致多种疾病，尤其是免疫缺陷患者。这些疾病包括真菌血症、心内膜炎、脑膜炎、关节炎、眼部感染、外阴阴道炎、尿路感染和关节疾病（Trofa等人，2008）。虽然一些副硅藻酸杆菌菌株对多烯类抗菌剂（如两性霉素B、氟康唑）敏感，但其他菌株已经具有耐药性（van Asbeck等人，2009）。C、krusei被认为比其他念珠菌致病性低，但疏水性更强。该因子在导致宿主表面定植的初始事件中起着重要作用。在这种情况下，这种酵母能够引起一系列临床表现，如真菌血症、眼内炎、关节炎和心内膜炎（Samaranayake和Samaranayake，1994）。
目前仍广泛用于抗真菌感染的抗生素是多烯类抗生素两性霉素B，尽管它有相当严重的副作用。其中最严重的是肾毒性，可能导致肾衰竭（Karimzadeh等人，2013年）。
因此，人们的注意力转向使用具有抗菌、抗真菌和抗生物膜特性的天然物质，这可能有助于治疗酵母生物膜感染。这些物质可以在低浓度下使用，对患者没有负面影响，也不会产生耐药性。此类天然物质的示例包括多酚、类黄酮、二苯乙烯、萜烯、多糖和常用香料的活性化合物（Rezanka et al.，2012）。例如，黄芩素，一种从黄芩中提取的类黄酮，具有抗氧化、神经保护、抗菌、抗病毒和抗真菌特性（Cao等人，2008）。壳聚糖是一种亲水性生物聚合物，是一种存在于甲壳类动物外壳中的多糖，具有广泛的抗菌活性（Martinez et al.，2010）。松萝酸是地衣的次生代谢产物，具有抗病毒、抗疟原虫、抗增殖、抗炎和镇痛作用（Pires et al.，2012）。
各种各样的显微技术被用来研究生物膜。这些方法包括光学显微镜、扫描激光共聚焦显微镜、扫描和透射电子显微镜、原子力显微镜等（McLean等人，2004）。光学显微镜与图像分析相结合，将生物膜视为被粘附细胞覆盖的二维区域，被认为是生物膜观察的基本方法。光学显微镜和图像分析的结合已用于评估附着细胞的数量、面积覆盖率、次要应用，包括测定附着细胞的生物体积以及实时观察细菌粘附和生物膜生长（An&Friedman，1997）。
本文的目的是报道以一种新的方式应用Cellavista装置研究酵母生物膜及其对抗菌剂反应的可能性。通过观察用天然物质代替抗生素处理真菌生物膜，证明了该方法的应用。自动显微镜Cellavista在生物膜分析中的优势之一是可以自动耦合单个图片和这些大表面的后续图像分析。一方面，通过消除生物膜的自然可变性，另一方面，由于生物膜环境中存在天然物质，不同生物膜布置的检测也会发生变化，从而可以显着改善最终结果。利用Cellavista设备提供的图像分析，我们显示了黄芩素、壳聚糖和松萝酸在治疗副硅藻菌和克鲁西弧菌生物膜方面的积极作用，并将这种治疗与两性霉素B的效果进行了比较，从而证明Cellavista可以作为一种快速、可靠的工具，用于确定抗菌剂对生物膜的有效性。
2、方法
2.1.真菌菌株和生长培养基
C、布拉格大学微生物学研究所提供的副硅藻DBM 2165和C.krusei DBM 2163。库存培养物储存于−70°C，每次实验前在30°C的麦芽提取物培养基（ME）中进行有氧预培养。试验也在麦芽提取物生长培养基中进行。
2.2.抗真菌药物
黄芩素、壳聚糖、松萝酸和两性霉素B购自Sigma Aldrich。黄芩素和松萝酸溶解在二甲基亚砜中（在所有试验中，培养基中二甲基亚砜的最终浓度均高达1%），浓度分别为0.004和0.03μg ml−1、壳聚糖的制备方法是将其溶解在少量乙酸中（最大为总体积的2%），然后将其溶解在无菌蒸馏水中，浓度为0.073μg l−将两性霉素B溶解在无菌蒸馏水中，浓度为0.029μg l−1、每种物质在4°C下储存直至使用（最多一周）。
2.3.抗真菌活性
根据Sharma et al.（2010），通过微量稀释法测定黄芩素、壳聚糖、松萝酸和两性霉素B的最小抑制浓度（MIC）。使用Bioscreen C analyzer（Oy Growth Curves Ab Ltd.，芬兰）通过监测光密度（ODwideband=420–580 nm），在100孔微量滴定板中进行培养。将体积为30μl的酵母标准细胞悬浮液（OD600 nm=0.1）添加到每个培养皿孔中。包括无药物和无酵母对照组。平板在30°C下孵育24小时。根据Andrews，2001的定义，MIC被指定为孵育过夜后不允许可见生长的最低浓度。对每个浓度的五个重复井进行实验。
2.4.生物膜形成
副硅藻和克鲁西梭菌生物膜是在商用预消毒聚苯乙烯平底96孔微孔板（firma）上形成的。向每个培养皿孔中添加210μl生长培养基中酵母的标准细胞悬浮液（OD600 nm=0.8）和70μl ME。对每种浓度的16个重复井进行了实验。
2.5.抗粘连药物效率
为了研究天然物质或抗生素对初始细胞粘附的影响，从一开始就将其中一种物质与酵母的标准细胞悬浮液一起添加到孔中。将微量滴定板盖上盖子，并在30°C、150 rpm下培养24小时。
2.6.抑制生物膜形成的药物效率
为了研究天然物质或抗生素对生物膜形成的影响，将含有标准酵母悬浮液的微量滴定板培养24小时，然后添加其中一种物质。在添加药物之前，不清洗微孔，以模拟物质与粘附细胞和悬浮细胞相互作用的自然作用机制条件。将微量滴定板盖上盖子，并在30°C、150 rpm下培养24小时。
2.7.预形成生物膜的药物效率
为了研究天然物质或抗生素对清除预先形成的生物膜的影响，将带有酵母标准细胞悬浮液的微量滴定板培养24小时，然后用盐水冲洗每个孔三次。然后，向每个孔中添加一种溶解在ME中的适当浓度的物质，并进行额外的24小时培养。用盖子覆盖微量滴定板，并在30°C、150 rpm下培养24小时。
2.8.Cellavista设备
Cellavista是一种全自动细胞成像仪，具有亮场和三个荧光通道（标准集包括七个激发波长以及相应的滤光片）。该光学系统由四个透镜组成：2×、4×、10×、20×和40×以及一个提供4 Mpixel图像的CCD相机。Cellavista可以评估6-384个微孔板、培养皿和显微镜载玻片。
可以使用一系列预定义的应用程序（细胞融合、悬浮细胞计数、细胞核等）。每个分析都提供相关的图像处理算法，该算法由算法评估的特定对象类型定义。用户可以为每个分析修改参数评估设置。
为了获得图像，将微孔板放入设备中，可以手动调整正确的图像设置（曝光、时间、光强、增益、焦距）。然后扫描选定的微孔板孔，图像自动耦合，生成整个孔的图像。根据选定的分析和用户定义的参数，图像分析然后通过Cellavista评估算法对每个分析进行自动和一致的阈值处理。根据分析类型，可以为图像分析设置不同的参数：例如细胞数量、细胞融合、细胞或菌落大小和形态以及荧光应用中的荧光强度。该设备还提供了模板功能，允许对具有相同布局的实验进行一致评估，而无需手动调整。对于每个单元，以二值图像形式显示的结果（评估对象突出显示），可以将其视为所有图像的马赛克（见图1，描述为时间过程）。对于96孔板，每个孔可拍摄的最大图像数量如表1所示。
表1 Cellavista 96孔微孔板每孔图像数。
2.9.使用Cellavista设备评估药物疗效
为了评估黄芩素、壳聚糖、松萝酸或两性霉素B对酵母生物膜形成不同阶段的影响，将制备的96孔微量滴定板（瑞士TPP AG）的每个孔用盐水冲洗三次，然后插入Cellavista自动显微镜，其中每个孔底部中心拍摄25张照片（20×物镜）。这些图像由Cellavista图像分析软件评估，并确定参数：对比度、最小区域亮度、强度、灵敏度和大小。将天然物质或抗生素对生物膜形成的影响与阴性对照（无药物培养）进行比较。所有实验中的对照组均被指定为100%，以便直接比较研究物质的影响
图1：。评估Cellavista设备获得的生物膜图像的时间过程（12小时、18小时和24小时）。（A）从一口井中的生物膜中无梗细胞的所有原生图像中剪下马赛克。（B）同一井的评价二值图像；黑色区域表示粘附细胞定植的区域。比例尺=400μm。
2.10.统计分析
通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的HSD检验，确定了对照组和物质有效性之间在粘附抑制、生物膜发育和形成生物膜方面的差异的显着性。