莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种绿色藻类谱系的单细胞绿藻,具有高细胞分裂率,是研究藻类生物学最发达的参考生物之一。莱茵衣藻还可以在条件简单的培养基中生长到高细胞密度,并且很容易通过各种方式使其出现金属过量或超载的情况,再通过监测某些金属相关基因的表达来评估其生长状况。莱茵衣藻能够通过胞内的重金属结合因子降低重金属对细胞的毒害,包括植物螯合肽、硫氧还蛋白、谷胱甘肽等大分子物质。此外,铜的毒性作用通常被认为是通过产生活性氧对细胞造成损害,而莱茵衣藻能够通过抗氧化物质抵御这样的损害。目前,对于莱茵衣藻富集重金属的途径以及相关的调控方法等方面并未完全弄清楚,特别是对重金属抗性相关的蛋白和调控机制的分析在国内的研究还比较少见。


在基因组学研究不断进步的当下,莱茵衣藻作为模式生物被广泛应用于转基因技术,构建新的突变品种。通过筛选突变株进一步鉴定与重金属抗性有关的基因成为研究衣藻重金属抗性的一个有效方法。


Aida基因突变型莱茵衣藻对水溶液中铜离子耐受性及吸附效率鉴定方法,包括以下步骤:


(1)衣藻在Cu2+胁迫下的生长状态:


按照衣藻细胞的培养方法,从新鲜的TAP平板上挑取野生型、突变体,将细胞培养到S1代。


在超净工作台内取样计数,然后用灭过菌的50mL离心管2500rpm,离心3min。将所有的细胞收集,用新鲜的TAP培养基重悬成浓度为1×108cell/mL的细胞悬液。


将灭过菌的0.1M的Cu2+溶液分别添加0、200、400、600、800、1000μL到吹气瓶中,在吹气瓶中加入2mL浓度为1×108cell/mL的细胞悬液。然后用新鲜的TAP液体培养基将每个吹气瓶中的液体补齐到200mL,获得分别用0、100、200、300、400、500μM Cu2+TAP培养基处理的衣藻细胞。



将处理好的细胞放置在光照培养箱内光周期培养,然后按1、2、3、4天的时间点取样计数,绘制生长曲线,结果如图2所示。从图中可以看出,发现Aida基因突变型莱茵衣藻具有高生长速率,且具有较高的铜离子耐受性;野生型WT藻株生长速率较慢,且容易受到铜离子的生长抑制作用。


(2)Cu2+吸附效率测定:


按照衣藻细胞的培养方法,从新鲜的TAP平板上挑取野生型、突变体,将细胞培养到S1代。在超净工作台内取样计数,然后用灭过菌的50mL离心管2500rpm,离心3min。将所有的细胞收集,用纯水清洗3遍,每次2500rpm,离心3min。最终用纯水调成浓度为1×107cell/mL的细胞悬液。


设定不同的吸附时间长度(0.25、0.5、1、2、3、4h)。将对应吸附时间点的样本分别转移至EP管内,6000g室温离心1min取上清,并做好标记。将上述样品加入新的24孔板中,对金属液浓度超过75μM的样品进行稀释,再按照国标法加入对应试剂等待显色完成,然后用酶标仪检测OD457的吸光值。将酶标仪测定的吸光值代入标准曲线中,获得不同上清样品Cu2+浓度数据,将获得数据导入GraphPad软件,绘制统计图,结果如图3所示。从图中可以看出,Aida基因突变型莱茵衣藻在同等吸附时间和铜离子浓度条件下,比野生型WT藻株具有更高的吸附效率。


总之,本发明依托于莱茵衣藻的野生型细胞株,从莱茵衣藻野生型细胞株构建的随机突变体文库中经铜离子耐受性细胞筛选及基因鉴定,鉴定获得了具有铜离子耐受功能调控的基因Aida,该基因突变后导致衣藻细胞株的铜离子胁迫下的生物量增加显著并且具有提高的铜离子吸附效率。


相关新闻推荐

1、基于特征微生物生长动力学的食品包装保质期预测

2、暴露于杀生物剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抗菌药敏性变化的影响

3、玉竹多糖-乳酸杆菌生长曲线影响因素

4、​啤酒中常见的厌氧菌有哪些?制作啤酒的微生物是什么

5、熟肉制品存放中微生物生长与水分的关系