生物膜-基质结构在毒力中的相关性
单独的产酸可能不是毒力表达的关键因素，而是酸性微环境如何在生物膜内形成和维持。先前研究的结果显示了生物膜中的平均pH值。相比之下，我们的数据显示了在复杂的三维生物膜结构内异质性分布的低pH值点状区域。
图5 完整混合菌种生物膜中原位pH微环境的映射。
(A) 在1%（w/v）蔗糖存在下生长115小时的混合菌种生物膜的代表性图像。左侧面板：细菌细胞（绿色）和胞外多糖（红色）的共聚焦图像。中间面板：同一视野下的原位pH图，显示pH值的空间分布（颜色条表示pH范围从3.5到7.0）。右侧面板：pH图与细菌细胞图像的叠加。箭头指示了三个不同的pH区域：(1) 微菌落/流体相界面附近接近中性的pH，(2) 微菌落内部的酸性“口袋”，以及(3) 微菌落/sHA界面处的酸性pH。比例尺=50 μm。(B) 将生物膜转移到pH 7.0缓冲液后，随时间监测微菌落内部（实心符号）和外部（空心符号）的pH变化。数据为平均值±标准差（n=5）。
局部酸性微环境的产生
完整生物膜的原位pH作图显示，尽管外部环境存在缓冲的中性pH，但在整个三维生物膜结构中存在空间异质性的pH微环境（图5A）。pH曲线中的较暗区域代表酸性pH值，而较亮区域代表接近中性的pH值（由图5A中的pH可视化条指示）。
低pH值的环境仅存在于生物膜内胞外多糖-微菌落复合体的内部（在图5A中突出显示）。这些细菌小岛的pH图特写视图揭示了三种不同的pH曲线（见箭头；图5A）：（1）在微菌落/流体相界面显示接近中性pH值的区域，（2）跨越结构（从sHA表面到流体相界面）的一系列酸性“口袋”，以及（3）在微菌落/sHA界面处的酸性pH值。存在包含低pH值（4.5至5.5）的离散区域表明，在这些特定区域积累和限制的酸在中性pH（7.0）缓冲液中孵育时不会迅速被中和；需要超过120分钟的暴露才能发生中和（图5B）。
微菌落-sHA界面处存在酸性区域对龋病发生有直接影响。存在于生物膜附着表面的酸会增加局部羟磷灰石矿物（牙釉质的主要成分）的脱矿。因此，我们获取了生物膜在sHA表面的横截面图像以及同一视野下的pH图，以说明表面附着的微菌落与pH值的空间分布（图6A）。显而易见，表面附着微菌落的存在（白线）与sHA表面的酸性pH值相对应（黄线突出的较暗区域）。通过比率成像分析进行的pH测量显示，微菌落/sHA界面处的pH值低于5.5（被认为是牙釉质快速溶解的临界pH值），并且与没有此类特定三维结构的区域相比，pH值显著更酸（在pH图中以橙色突出显示）（P<0.05；图6B）。
图6 表面附着的胞外多糖-微菌落复合体与sHA表面酸性pH的相关性。
(A) 在sHA表面水平获取的混合菌种生物膜的横截面图像。左图：细菌细胞（绿色）和胞外多糖（红色）的共聚焦图像，显示表面附着的微菌落（白线勾勒）。右图：同一视野下的原位pH图，显示sHA表面的pH分布。黄色线突出了与表面附着微菌落相对应的酸性区域（较暗区域）。比例尺=50 μm。(B) 在存在表面附着微菌落的区域（“有微菌落”）和没有此类结构的区域（“无微菌落”）测量的sHA表面pH值的定量比较。数据为平均值±标准差（n=10）。星号(*)表示两组之间有显著差异（P<0.05）。虚线表示牙釉质快速溶解的临界pH值（pH 5.5）。
在生物膜附着表面存在局部化和高浓度的酸具有临床意义，因为它可以解释人类疾病发作期间龋损的异质性模式。龋病的特征是牙釉质在菌斑下出现时间和局部的/点状的脱矿区域，临床上称为“白斑”。这些“白斑”最终会融合成更广泛的病变，而不是弥散且均匀的侵蚀层。因此，病变的出现和脱矿的程度可能与表面附着的胞外多糖-微菌落复合体的大小有关。相关性分析表明，sHA表面的低pH值与这些细菌小岛的直径或高度之间存在线性关系（图7）。
图7 微菌落大小与sHA表面pH值之间的相关性。
散点图显示了在115小时混合菌种生物膜中，sHA表面pH值与表面附着的胞外多糖-微菌落复合体的直径（A）和高度（B）之间的关系。每个数据点代表一个单独的微菌落。使用Pearson相关系数（r）和相应的p值评估线性相关性。
用 gtfB 无效突变株形成的生物膜（缺乏三维基质和胞外多糖-微菌落复合体）在中性pH缓冲液中孵育后很容易被中和，并且无法产生任何酸性微环境。有趣的是，用 gtfC 无效突变株形成的生物膜包含孤立的小型胞外多糖-微菌落复合体，这些复合体显示出一些酸性口袋，尽管它们在30分钟内就被中和了。总的来说，这些数据清楚地表明，存在显著的扩散限制，这与富含胞外多糖基质的组装和胞外多糖包裹的微菌落的大小有关。它们的存在可以将酸截留在sHA表面，和/或限制中和性缓冲液（如唾液）进入生物膜内的低pH区域。这些数据与Tatevossian的发现一致，后者显示人牙菌斑液中的溶质浓度与唾液中观察到的显著不同。
涉及限制扩散的确切机制尚不清楚
有可能口腔链球菌产生的葡聚糖的存在限制了带电离子进出菌斑生物膜的扩散，而未带电的物质，如蔗糖，则可以自由扩散。相反，其他人注意到，在使用人工菌斑和体外建模时，胞外多糖对酸扩散几乎没有影响。然而，这些研究都没有像我们在这里所做的那样评估完整的生物膜。我们的数据显示了基质如何三维组装以及如何与细菌细胞空间排列以充当扩散限制性物理屏障的重要性。
这些结构内存在高密度的产酸和耐酸细菌，可以促进蔗糖（和其他可发酵碳水化合物）通过糖酵解途径转化为酸。此外，变形链球菌葡聚糖酶（也在生物膜内上调）对胞外可溶性葡聚糖的降解以及细胞内多糖的降解增加了可发酵糖（如麦芽糖和葡萄糖）的可用性。这些碳水化合物的代谢也可能导致所得三维环境的酸化。生物膜中产碱菌的存在也可能影响局部pH。使用代谢活性标记物可能有助于阐明酸化是一个活跃的过程还是细胞数量（密度）的次要后果。很明显，物理和代谢因素的结合至少可以部分解释我们体外生物膜中点状酸性区域的空间分布，以及龋活跃个体菌斑中观察到的低空腹pH值。
异质性酸性环境的形成具有生物学意义，因为根据生态菌斑模型，pH变化可能引发微生物种群的动态变化。低pH值的龛位会激活聚集在这些胞外多糖庇护的酸性口袋中的特定生物的酸应激适应反应，从而有利于耐酸和结合葡聚糖的病原体（如最初数量较少的变形链球菌）的存活/生长。局部pH浓度也会影响整个三维生物膜结构中细菌种类的空间分布。微生物的定位及其应激反应机制可能与其对低pH环境的敏感性或亲和力相关。此外，持续的低pH龛位也可能影响 gtf 基因的表达，因为 gtfBC 的表达会被酸化和过量可代谢碳水化合物的存在所诱导。因此，这些基因很可能会在局部上调，与正在进行活跃基质重塑和产酸的区域相一致。
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