猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种肠道传染性疾病，该病毒可感染所有年龄段的猪，但7日龄以内的仔猪最易感，主要引起仔猪急性腹泻、呕吐、脱水甚至死亡，发病率和死亡率可高达100%。自2010年以来，PEDV变异毒株引起的仔猪腹泻呈现新的流行特征，即使免疫过PED疫苗的猪场也未能幸免，给养猪业造成了巨大的经济损失，因此，当务之急是采取有力的措施加强对PED的防控。
目前PED的防控除了加强饲养管理外，主要以疫苗预防为主，但由于病毒的高变异性，现有疫苗已不能提供足够的保护力，因此，开发可抑制PEDV感染的药物迫在眉睫。PEDV与经典冠状病毒生命周期一致，该病毒的S蛋白与宿主细胞表面的受体结合并吸附，从而启动病毒粒子的生命周期。PEDV基因组与细胞核糖体结合后翻译非结构蛋白(non-structural protein 1-16，nsp1-16)和逆转录复合物(reverse transcription complex，RTC)，不连续的基因组可翻译结构蛋白:纤突蛋白(spike protein，S蛋白)、膜蛋白(membrane protein，M蛋白)、包膜蛋白(envelope protein，E蛋白)、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N蛋白)和辅助蛋白(ORF3蛋白)。与N蛋白结合的病毒基因组在内质网-高尔基体中间区室(ERGIC)进行组装并进入含有病毒结构蛋白(S、E和M蛋白)的ERGIC膜，导致成熟病毒体的形成，完成病毒粒子的复制过程，最后病毒粒子经细胞膜以胞吐的方式释放到细胞外，又可开始新一轮的感染。尽管目前国内外科研者针对PEDV生命周期的不同阶段已发现多种能够抑制PEDV活性的抗病毒药物，但多数正处于实验室的研究阶段，尚未获得批准。
盐霉素(salinomycin，SLM)又名沙利霉素，是1968年首次由日本科研株式会社发现的一元羧酸聚醚类广谱抗生素，其对癌症、球虫原虫、革兰阳性细菌和耐药菌株都具有抑制活性。SLM作用之多的原因可能是因为其可以参与多种信号通路的调节，例如，抑制Wnt/β-catenin信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，启动细胞的自噬，降低三磷酸腺苷(ATP)的水平，促进活性氧(ROS)的产生，触发DNA损伤和预防DNA修复，抑制核转录因子(NF-κB)信号通路。以上信号通路与病毒感染靶细胞后的增殖密切相关，说明SLM可能是一种抗病毒候选药物，然而SLM对PEDV的抑制效果尚不清楚。
本研究旨在探索SLM体外对PEDV的抑制效果及其对病毒复制周期的影响，为SLM作为一种新的抗PEDV药物的开发提供理论支持，并为后期SLM抑制PEDV感染机制的研究奠定基础。
1材料与方法
1.1细胞、病毒和主要试剂
非洲绿猴肾细胞(Vero)、PEDV CV777毒株均由本实验室保存。MEM培养基购自Gibco公司;胎牛血清(FBS)、胰酶(TRYPSIN/EDTA)购自Multicell公司;PEDV N蛋白单克隆抗体由本实验室制备并保存;小鼠抗GAPDH单克隆抗体、ECL化学发光超敏显色试剂盒购自翌圣公司;HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)购自博奥龙公司;CCK-8试剂盒购自Biosharp公司;2×AugeGreen Master Mix购自UE公司;盐霉素购自MCE公司。
1.2病毒滴度的测定
将Vero细胞接种于Bioscreen全自动生长曲线分析仪的96孔细胞培养板，置于37℃5%CO2细胞培养箱中，待细胞长到90%后，每孔接种100μL倍比稀释(10-2～10-7)的PEDV病毒液，接毒后72 h统计细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。用Reed-Muench两式法计算病毒滴度(TCID50)。
1.3病毒生长曲线的测定
将Vero细胞接种于细胞培养皿，待细胞长到90%，将细胞上清液换为维持液培养12 h，吸出细胞上清液，用0.01 mol·L-1pH 7.2～7.4的PBS洗涤细胞，然后感染0.5 MOI PEDV，对照组加入等量维持液，37℃孵育2 h后更换新维持液继续培养，最后收集感染后1、12、24、48、60 h的病毒液，测定病毒吸光度（OD600）。
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