2结果与分析
2.1 PMEC的形态学观察
经组合酶消化组织块法分离PMEC,第1代细胞大小不等,种类较为杂乱,但能观察到有部分细胞贴壁(图1A);在培养第3代时PMEC与成纤维细胞混杂生长形态多为梭状与多角形(图1B);当传至第8代时,大部分成纤维细胞已被去除,保留了较纯的PMEC,其形态多为鹅卵石状,表现为单层、上皮样形态,形成单层聚集形岛屿(图1C);重新复苏后的PMEC生长状态良好(图1D)。
A.第1代细胞,红框所示为贴壁细胞;B.第3代细胞;C.第8代细胞;D.复苏后第8代细胞。
图1 PMEC的形态学观察
2.2 PMEC生长曲线的测绘
如图2所示,PMEC生长曲线呈“S”型,培养1~3 d时处于潜伏期,细胞生长较为缓慢;培养3~5 d时为对数生长期,细胞增殖速度明显提高;培养7~8 d后进入平台期,细胞增殖速度大幅度降低。上述结果表明,本试验条件下分离培养的PMEC生长状态良好。
2.3 PMEC中ZO-1蛋白的表达
IFA结果可见,ZO-1抗体可与蛋白特异性结合,细胞与细胞之间出现了红色荧光信号,表明PMEC之间形成良好的紧密连接(图3)。
图2 PMEC生长曲线
图3 PMEC中ZO-1的表达
2.4 PMEC中CK-18蛋白的表达
IFA结果可见,CK-18抗体可与该细胞特异性结合,细胞胞浆出现了绿色荧光信号,表明该细胞表达CK-18(图4)。
图4 PMEC中CK-18的表达
2.5 PMEC中CNS2基因的转录
对PMEC标志基因CNS2进行RT-PCR检测,结果可见该细胞转录CNS2基因,且PMEC经0.2 mg/L与2 mg/L的催乳素刺激后,CNS2基因的转录相比对照组均有升高的趋势。(图5)。
2.6 PMEC中CNS2蛋白的表达
Western blot检测结果如图6所示,未经催乳素刺激的PMEC表达的CNS2较少,而催乳素刺激后PMEC表达的CNS2增多,且随着催乳素浓度的增大CNS2表达增加(图6A)。将催乳素刺激组与阴性对照组蛋白的内参归一化后灰度值统计结果显示,催乳素刺激组与阴性对照组相比,CNS2蛋白表达极显著增加,且随着催乳素浓度的增加,该蛋白的表达也存在显著的增加(图6B)。
M.DL 100 DNA Marker;1.未经催乳素刺激的PMEC;2.0.2 mg/L催乳素刺激的PMEC;3.2 mg/L催乳素刺激的PMEC;4.从母猪乳汁中提取的总RNA(阳性对照);5.阴性水对照。
图5催乳素刺激后CNS2基因的转录
1.未经催乳素刺激的PMEC;2.经0.2 mg/L催乳素刺激的PMEC;3.经2 mg/L催乳素刺激的PMEC;4.母猪乳汁中提取的蛋白。?表示P<0.05,???表示P<0.001,????表示P<0.000 1。
图6催乳素刺激后CNS2蛋白的表达
3讨论
近几年来,国内外学者已成功培养出了多种动物的MEC,如人、小鼠、奶牛、水牛、绵羊、山羊等,但是国内对于PMEC分离与培养的研究还比较少。本研究采用组合酶消化组织块的方法对PMEC进行了分离培养,并通过形态学观察、生长曲线测定、IFA、PCR等多种手段对其进行鉴定,结果表明本研究成功分离了PMEC,且细胞间形成紧密连接,可用于体外共培养模型的建立。
本研究分离和培养PMEC所用的组合酶消化组织块法是基于从啮齿动物身上获得MEC的方案以及Dahanayaka等分离母猪MEC的方法所制定。组合酶消化组织块法是使用透明质酸酶和胶原蛋白酶联合消化猪乳腺组织后获得PMEC的方法。此方法用时短,采取的组织腺泡发育越好获得的上皮细胞数目越多,虽会掺杂少量成纤维细胞,但因成纤维细胞与PMEC对胰酶的敏感性不同,可在每次传代时使用胰酶消化的时间不同进行纯化,进而得到纯度较高的PMEC。由于庆大霉素可诱导成纤维细胞凋亡(程序性细胞死亡),但MEC对庆大霉素具有高度耐药性。本研究方法在组织消化液和初始培养液中使用庆大霉素(50μg/mL)来培养从新鲜猪乳腺组织分离的PMEC,以利于去除分离细胞中的成纤维细胞。
MEC的鉴定主要以检测CK-7、CK-8和CK-18为主,其中检测CK-18较为普遍。CK-18是一种上皮细胞特有的中间细丝蛋白,是细胞骨架的组成成分,该蛋白是上皮细胞谱系的特异性标记物,其广泛地应用于多种动物MEC的鉴定。本研究采用IFA对细胞中CK-18进行鉴定,发现分离的细胞高表达CK-18。ZO-1作为特征性紧密连接分子的完整膜蛋白,在细胞间形成单层屏障的过程中起到尤为重要的作用。本研究采用IFA对分离的PMEC进行ZO-1检测,结果发现细胞间高表达ZO-1,表明PMEC间可以形成紧密连接,为体外共培养模型的建立奠定基础。CNS2是PMEC的特异性标志物,CNS2的表达与哺乳期乳腺产生催乳素有关。本研究发现不同浓度催乳素刺激下,可以检测到CNS2的表达,且其表达量与催乳素呈剂量依赖性。
本研究成功分离并培养出原代PMEC,可以用于实验室研究,为未来研究猪乳腺疾病以及人乳腺类疾病提供了可靠的模型。
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