摘要
毒性生物膜是导致一系列感染（包括口腔疾病）的原因。所有生物膜都含有微生物来源的胞外基质。在牙齿获得性膜和细菌表面形成的胞外多糖为微生物提供了结合位点；最终，积累的胞外多糖将微生物细胞包裹其中。此基质内细菌的代谢活动会导致环境酸化。我们利用一个混合菌种系统，探索了由变形链球菌产生的胞外多糖基质如何调节唾液包被的磷灰石表面上生物膜形态发生过程中的三维结构和种群动态变化。同时，我们采用一种新颖的三维原位pH作图技术，研究了基质是否影响完整生物膜内pH微环境的形成。数据显示，胞外多糖基质的产生通过局部的细胞-基质相互作用，形成了一个由胞外多糖包裹的细菌小岛（微菌落）组成的复杂网络，从而创造了空间异质性。
这种复杂的三维结构在整个生物膜中形成了分隔的酸性和富含胞外多糖的微环境，这触发了致病性变形链球菌在混合菌种系统中的优势地位。三维基质和胞外多糖包裹的微菌落的建立主要由变形链球菌的 gtfB/gtfC 基因介导，这些基因的表达在内氏放线菌和口腔链球菌存在时会增强。酸性区域仅存在于被胞外多糖保护的细菌小岛内部，胞外多糖阻碍了缓冲液（pH 7.0）的快速中和。结果，在附着表面的特定位置检测到了低pH（<5.5）的区域。与这些结构之外的细胞相比，胞外多糖-微菌落复合体内部的细胞对氯己定的耐药性增强。我们的结果阐明了三维环境中基质结构与pH异质性之间的关键相互作用。在靠近磷灰石表面处形成结构化的酸性微环境是与致龋生物膜毒力相关的一个基本因素。这些观察结果的意义可能超越口腔范畴，因为基质是所有生物膜的固有特征。
引言
在表面形成的毒性生物膜是与人类多种疾病和感染相关的主要生物学现象，包括口腔疾病、天然瓣膜心内膜炎以及许多院内感染。人类牙菌斑是自然界中最复杂的生物膜系统之一，因为它不断暴露于环境挑战之下，因此可以作为研究生物膜生物学的一般模型。龋病是一种高度流行且花费高昂的生物膜依赖性口腔感染性疾病，它仍然是导致急诊就诊和工作或学习缺勤的重要原因。这种普遍存在的疾病源于牙齿表面特定的口腔细菌、这些生物体产生的产物、唾液成分以及膳食碳水化合物之间发生的复杂相互作用。这些相互作用调节了从健康状态到疾病状态（龋病）的转变，其特征是在易感牙齿表面建立了致龋生物膜，并最终通过酸溶解牙釉质而导致龋洞形成。
所有细菌生物膜至少有一个共同特性：存在一个源自细菌的基质，它包裹着细胞，有助于形成牢固附着在表面的多细胞结构。生物膜基质的组成和结构可能与微生物组分一样多变，受局部环境条件的影响，并且可以随时间改变。在细菌生物膜的基质中已鉴定出胞外多糖、蛋白质、脂质、核酸、脂磷壁酸甚至脂多糖。基质被认为对于生物膜生活方式的存在和细菌病原体毒力的充分表达至关重要。然而，以往大多数研究都集中在生物膜的（细菌）细胞方面，而基质在毒力表达中所起的功能作用受到的关注有限。
胞外多糖是致龋口腔生物膜基质的关键成分，并且被认为是参与龋病发病机制的公认毒力因子。在口腔中，高度多样化的微生物群落不断地与牙齿表面上一层称为获得性膜的蛋白质薄膜相互作用。获得性膜源自哺乳动物和细菌来源（如唾液蛋白和外酶），一小群微生物（主要是链球菌和放线菌属）可以少量粘附其上。致龋微生物如变形链球菌也可能存在于这个初始定植群落中，尽管其数量各异，这取决于宿主的饮食。然而，环境变化，例如频繁摄入蔗糖，会显著影响生物膜的发育，因为它为获得性膜表面的胞外多糖生产提供了底物。来自变形链球菌的葡萄糖基转移酶是获得性膜的组成部分，能够就地利用蔗糖合成葡聚糖。这些表面形成的聚合物为随后的定植和变形链球菌（通过几种膜相关的葡聚糖结合蛋白）及其他微生物的局部积累提供了细菌结合位点。Gtfs也能结合许多口腔细菌，即使是那些不合成Gtfs的细菌，从而将它们转变为事实上的葡聚糖生产者。因此，获得性膜和微生物表面的细菌产物为富含胞外多糖的基质（及其结合位点）提供了早期基础，从而极大地影响了毒性生物膜形成的轨迹。
与此同时，蔗糖也可以在生物膜内发酵产酸。其他可发酵的碳水化合物（例如葡萄糖、果糖和麦芽糖）也可以转化为酸，但很少作为胞外多糖合成的底物。富含胞外多糖基质的酸化有利于耐受酸胁迫的微生物生长，并促进邻近牙釉质的脱矿，从而导致龋洞形成的临床发作。因此，致龋生物膜在体内由混合微生物群组成，它们被共同的基质结合在一起；所有这些微生物通常都是强产酸菌和耐酸菌，从而创造了一个高粘附性、高内聚性和酸性的环境。基质如何介导三维生物膜结构的构建和空间异质性的建立，以及为什么酸会在口腔生物膜内积累，仍然是有趣的谜团，尤其是考虑到牙齿周围有大量具有缓冲能力的唾液，理论上应该能够中和这些酸。
基质成分，如胞外多糖，可能会影响物质进出生物膜的扩散，或许有助于在生物膜内创造多样化的微环境。然而，关于多糖如何三维组装的知识是有限的，特别是由于研究完整生物膜基质的困难。多糖会受到葡聚糖水解酶作用而发生结构修饰，并且在完整的牙菌斑生物膜内可能分布不均匀或不均一。以前试图表征生物膜内独特微环境的研究在很大程度上依赖于侵入性技术（例如使用探针或微传感器），这会改变基质的复杂结构和物理性质，使数据解读复杂化。因此，胞外多糖在生物膜内酸性环境形成和结构中的确切作用在很大程度上仍未得到探索。
在本研究中，我们专注于理解基质在以下两方面的功能：（1）三维生物膜结构的构建，以及（2）在混合菌种系统中调节由此产生的微环境pH。为了实现这些目标，我们设计了新颖的方法，即在基质合成过程中加入荧光团或荧光pH指示剂。这项技术使我们能够以连续的方式追踪复杂基质结构的发育，并同时绘制未受干扰的三维生物膜结构内的pH空间分布图。
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