本研究通过对敲除三种终端氧化酶（cydAB、cyoABCD、cbdAB）的大肠杆菌ECOM3菌株进行为期60天（约700代）的适应性进化，使其恢复在有氧M9葡萄糖培养基上的生长能力。进化过程中逐步减少营养补充，并通过每日传代维持对数生长期。进化结束后，对三个独立群体进行表型评估，测定其有氧/厌氧条件下的生长速率、底物摄取、摄氧率及主要发酵产物（乳酸、乙酸）分泌速率。利用定量PCR分析关键基因（如ygiN、sodAB）的表达变化，以解释残余摄氧能力的分子机制。通过单克隆筛选获得高产D-乳酸的菌株，并结合基因组规模代谢模型iAF1260进行通量平衡分析与相平面分析，在实验数据约束下模拟代谢网络扰动，揭示进化菌株从有氧呼吸转向发酵产乳酸的代谢重编程机制。
适应性进化
突变株通过在添加 2 g/L D-葡萄糖和微量元素的 M9 最低培养基中连续传代进行适应。进化开始时，将 ECOM3 突变株涂布于含 2 g/L 葡萄糖、微量元素、EZ 补充剂和卡那霉素抗生素的固体 M9 最低培养基上，于 37°C 过夜培养。从 ECOM3 平板上挑取一个单菌落，重悬于 10 μl 无菌水中，接种至三个 500 ml 锥形瓶中，每瓶含 250 ml 添加了 20 ml 5× EZ 补充剂（Teknova）的 M9 最低培养基。培养瓶在 37°C 下培养，用搅拌子混匀并通气（约 1,000 rpm）。每天测定 600 nm 处的光密度（OD），并将细胞转入新鲜培养基。每次传代的接种量根据生长速率的变化进行调整，以保证培养物在进入下一个传代之前不会进入稳定期。在进化的最初两周内，培养基中 EZ 补充剂的添加量呈指数递减。进化在含氧条件下进行 60 天（约 700 代），直至达到稳定的生长速率。每隔一天用 PCR 筛选培养物是否污染。每周还向进化体系中加入 50 μg/ml 卡那霉素一次，以防止污染。在进化的第 1 天、第 30 天（约 268 次倍增）和第 60 天（约 700 次倍增）对每个进化细胞群体进行取样，以考察适应性进化对细胞代谢的影响。同时在第 1 天及此后每 2 天对培养物进行冻存。
表型评估
为测定生长速率和副产物分泌，每个群体均在 37°C 的有氧和缺氧条件下进行分批培养。有氧培养在 500 ml 锥形瓶中进行，每瓶含 250 ml 添加微量元素、以 2 g/L 葡萄糖为唯一碳源的 M9 最低培养基，温度由循环水浴控制在 37°C，用搅拌子以约 1,000 rpm 的转速混匀并通气。厌氧培养在 250 ml 锥形瓶中进行，每瓶含 200 ml 培养基，瓶口用带必要进气管的橡胶塞密封。缺氧条件通过以 1 ml/min 的流速持续通入 95% N₂–5% CO₂ 混合气体实现；温度由循环水浴控制，搅拌转速约为 200 rpm。定期（每 30 分钟）从分批培养物中取样，经 0.2 μm 滤膜过滤后，于 −20°C 保存，用于副产物分泌分析。培养基中的葡萄糖浓度用酶法试剂盒（R-Biopharm）测定；D-乳酸分泌量用高效液相色谱（HPLC，Waters，Milford，MA）配合折射指数检测器测定，色谱柱为 Bio-Rad Aminex HPX-87-H 离子排阻柱（进样量 50 μl），流动相为 5 mM H₂SO₄（0.6 ml/min，65°C）。发酵液中代谢物和有机酸的种类进一步用酶法试剂盒（R-Biopharm）验证。每个需氧培养物的摄氧率通过极谱式溶氧探头（Cole-Parmer Instruments，Vernon Hills，IL）在密闭呼吸测定室中测定溶解氧的消耗速率来确定。
定量 PCR（qPCR）
从指数生长期的细胞中提取 RNA 样品，加入两倍体积的 RNA Protect（Qiagen，Valencia，CA）。总 RNA 用 RNeasy 小量提取试剂盒（Qiagen）分离。对 10 μg 总 RNA 进行反转录。反转录混合液（60 μl）含 10 μg 总 RNA、75 μg 随机引物、1× 第一链缓冲液、10 mM 二硫苏糖醇、0.5 mM 脱氧核苷三磷酸、30 U Superase 和 1,500 U Superscript II。混合液在热循环仪（Bio-Rad，Hercules，CA）中依次于 25°C 孵育 10 分钟、37°C 1 小时、42°C 1 小时，随后于 70°C 孵育 10 分钟使反转录酶失活。然后加入 20 μl 1 N NaOH 并于 65°C 孵育 30 分钟以降解 RNA，再加入 20 μl 1 N HCl 中和溶液。用 QIAquick PCR 纯化试剂盒纯化 cDNA 合成产物，纯化后对 cDNA 定量并直接用于定量 PCR 反应。50 μl qPCR 反应体系含 25 μl Sybr green taq 预混液（Qiagen）、0.2 μM 正向引物、0.2 μM 反向引物，以 cDNA 为模板。每个 qPCR 反应在 Bio-Rad 热循环仪中设三个平行重复，反应条件为：95°C 15 分钟；94°C 15 秒、52°C 30 秒、72°C 30 秒，共 40 个循环。在含氧和缺氧生长条件下分析进化 ECOM3 菌株的基因表达，并与相似生长条件下的野生型菌株进行比较。为确定每组引物的结合亲和力，针对每对引物计算标准曲线并由此获得反应效率。利用标准曲线，通过将各基因的 cDNA 量与同一样品中 acpP（酰基载体蛋白）cDNA 的量进行归一化，得到各基因的相对 cDNA 量。选择 acpP 作为内参基因，是因为它在野生型和突变体的有氧及厌氧条件下均为组成型表达。
单克隆分析
将进化 60 天的 ECOM3 群体在含 2 g/L 葡萄糖和 50 μg/ml 卡那霉素的固体 M9 培养基上过夜培养。从每个平板随机挑取 10 个单菌落，在含 2 g/L 葡萄糖的 M9 最低培养基中过夜培养。细胞于 5,000 rpm 离心（Thermo CR3i）收集，用无碳源的 M9 最低培养基洗涤三次，接种至 Bioscreen C 生长曲线分析仪（Growth Curves）中。培养物接种于含 300 μl 添加微量元素和 2 g/L 葡萄糖的 M9 最低培养基的孔中，每孔初始 OD 低于 0.05。细胞在 37°C 下持续振荡培养 8 小时以保证充分混匀和通气，每 15 分钟测定一次 600 nm 处的 OD。细胞进入稳定期后停止测定，用 HPLC 测定最终 D-乳酸浓度（g/L）。鉴定出产率最高的菌株，并进行有氧分批培养。菌株在 500 ml 锥形瓶中以 250 ml M9 最低培养基培养，37°C 持续振荡 8 小时。每 30 分钟取样、过滤并用 HPLC（Waters，Milford，MA）分析。生长速率（1/h）、摄氧率（mmol/g [干重 DW]/h）、糖摄取速率（mmol/g [DW]/h）和产物分泌速率（mmol/g [DW]/h）按上述方法测定。
计算分析
计算分析采用大肠杆菌 K-12 MG1655 的基因组规模代谢模型 iAF1260。模拟使用 Simpheny 软件平台（Genomatica，San Diego，CA）和 Matlab COBRA 工具箱进行，采用已建立的基因删除和稳健性分析方法。该代谢重构采用通量平衡分析进行检验。通量平衡分析可给出一个解空间，其中包含满足给定约束的所有可能的稳态通量分布。用相平面分析计算代谢网络在两个反应（如乳酸脱氢酶 LDH 和生物量函数（生长））活性变化范围内所能表现出的特征表型范围（见补充材料）。模型通过实验数据进行约束，将摄取/分泌通量的下界/上界设定为实验测定值。为考虑实验不确定性，这些边界设定为实验测定均值的一个实验标准差范围之内。
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