为了提高植物乳杆菌Lactobacillus plantarum KLDS1.0386的胆盐水解酶产量，本实验通过响应面法对其发酵培养基进行优化。通过单因素实验、Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验和Box-Behnken实验，最终获得最优培养基为：葡萄糖18.2 g/L、蛋白胨15.03 g/L、酵母粉9.97 g/L、乙酸钠3.13 g/L、柠檬酸氢二铵2.00 g/L、磷酸氢二钾2.00 g/L、硫酸锰0.25 g/L、硫酸镁0.58 g/L。优化前植物乳杆菌KLDS1.0386产胆盐水解酶的比酶活为1.04 U/mg，经过培养基的优化后，胆盐水解酶的比酶活为3.37 U/mg，比优化前提高了3.24倍。且实验结果与模型预测结果误差在允许范围内，说明该模型可以投入使用。
随着人们生活水平的提高，高血压、冠心病等心血管疾病的发病率逐年上升，医学研究表明，人体内胆固醇含量过高是心血管疾病发生的重要原因之一。目前，国内外对于乳酸菌降胆固醇的研究越来越多，乳酸菌在生长代谢的过程中会产生胆盐水解酶（bile salt hydrolase，BSH），它是一种胞内酶，能将体内的结合胆盐降解成游离胆酸和氨基酸，游离胆酸能与血清中的胆固醇发生共沉淀，随粪便一同排出体外，因此降低了胆固醇水平。所以提高细菌中胆盐水解酶的含量，对降低胆固醇水平具有很重要的意义。国内方面利用响应面实验优化BSH的培养基成分报道比较少，为了提高胆盐水解酶活力，本实验选择了植物乳杆菌KLDS1.0386，该菌具有很好的益生特性，而且体外降胆固醇能力达到55.71%，在单因素实验的基础上进行了Plackett-Burman实验，筛选出影响BSH比酶活的3个显著性因素，并进行最陡爬坡实验确定出实验因素的中心点，设计Box-Behnken实验，最终进行响应面分析，建立培养基成分与胆盐水解酶比酶活之间的回归方程模型，以期为以后高产胆盐水解酶乳酸菌发酵制品的开发和研制提供依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
植物乳杆菌KLDS1.0386分离自内蒙古传统发酵乳制品，由东北农业大学教育部重点实验室工业微生物菌种保藏中心（KLDS-DICC）提供；茚三酮上海惠世生化试剂有限公司；95%乙醇天津市富宇精细化工有限公司；MRS液体培养基天津基准化学试剂有限公司；考马斯亮蓝，牛血清白蛋白，溶菌酶。
GL-21M型离心机；VD-1320型洁净工作台；DHP-9272型电热恒温培养箱；YH-2S型远红外恒温干燥箱；微生物曲线分析仪；XK96-A型快速混匀器；DU800型紫外分光光度计。
1.2实验方法
1.2.1植物乳杆菌KLDS1.0386的生长曲线挑取平板上的植物乳杆菌单菌落，接种到MRS液体培养基中，传代培养2次后，以2%的接种量接种于MRS液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养。每隔2 h于紫外分光光度计上测一次OD620，直到24 h，记录菌的生长情况，绘制生长曲线。
1.2.2BSH比酶活测定将植物乳杆菌KLDS1.0386传代培养2次后，接种到MRS液体培养基中，培养至稳定初期，离心（10000×g，4℃，10 min）留菌体，用磷酸缓冲液清洗两次后，加入VC磷酸缓冲液和溶菌酶溶液，37℃水浴30 min后，在冰浴条件下进行细胞超声破碎（600 W，15 min），离心后留上清，即为粗酶液。
采用茚三酮显色法来测定BSH酶活，取0.1 mL的粗酶液，加入0.1 mL的50 mmol/L牛磺脱氧胆盐溶液、0.8 mL的pH6.0的磷酸钠缓冲液，振荡混匀后37℃水浴30 min，之后冷却终止反应，加入0.5 mL的三氯乙酸（15%，w/v）沉淀蛋白质，3 min后离心（10000×g，4℃，10 min），留上清液，并加入1.5 mL的茚三酮显色液，混匀后沸水浴15 min，冰浴至室温，在紫外分光光度计上测得在570 nm处的最大吸收值。蛋白质浓度的测定参照文献，比酶活定义为每毫克蛋白质所含的胆汁盐水解酶的单位（U）数。
1.2.3单因素实验
以普通MRS培养基为基础，分别以可溶性淀粉、果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖作为碳源，添加量为20 g/L，进行比酶活测定，从而确定最佳碳源。
在最佳碳源的基础上，将氮源分别替换成蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、大豆蛋白胨、牛肉膏，添加量为25 g/L，进行比酶活测定，确定最佳氮源。
在最佳碳源和氮源基础上，进行复合氮源的优化，共设计4组实验，1号：蛋白胨5 g/L、酵母粉20 g/L，2号：蛋白胨10 g/L、酵母粉15 g/L，3号：蛋白胨15 g/L、酵母粉10 g/L，4号：蛋白胨20 g/L、酵母粉5 g/L，筛选出胆盐水解酶产量最高的氮源组合。1.2.4Plackett-Burman实验根据单因素实验结果，葡萄糖、蛋白胨和酵母粉对胆盐水解酶产量有很重要的影响，乙酸钠、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵、硫酸锰、硫酸镁都会有重要影响，所以此8种成分，被选为Plackett-Burman实验的影响因素，胆盐水解酶比酶活作为响应值。利用软件Design Expert进行Plackett-Burman实验的设计，每一因素设置高（+1）、低（-1）两个水平，高水平为低水平的1.5倍，总共进行12组实验，进而筛选出对胆盐水解酶比酶活影响最显著的因素。
表1 Plackett-Burman实验因素及水平表
1.2.5最陡爬坡实验
根据Plackett-Burman实验的显著性结果，设计最陡爬坡实验，筛选出胆盐水解酶比酶活最高时显著性因素的浓度梯度。
1.2.6Box-Behnken实验
根据Plackett-Burman实验和最陡爬坡实验的结果，利用Design Expert软件进行Box-Behnken实验设计，3个影响因素，3个水平，共形成15组实验，实验设计如表2所示。实验结果用Design-Expet软件进行回归分析，确定优化后的最佳培养基。
表2 Box-Behnken实验因素及水平表
1.3数据统计方法
利用SPSS 19分析软件对数据进行方差分析，离散度通过标准差来表示，结果数据用平均值±标准差来表示。
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