摘要
Latrepirdine（Dimebon；dimebolin）是一种神经活性化合物，在实验动物中与增强认知、神经保护和神经发生相关，并已进入阿尔茨海默病（AD）和亨廷顿病（HD）的 II 期临床试验。基于近期研究提示 latrepirdine 可保护细胞免受与聚集性神经退行相关蛋白（包括 Aβ42 和 γ-突触核蛋白）表达相关的细胞毒性，我们试图确定 latrepirdine 是否对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有保护作用。我们分别并平行地在酵母中表达了多种神经退行相关蛋白，包括 α-突触核蛋白（α-syn）、与肌萎缩侧索硬化（ALS）相关的基因 TDP43 和 FUS，以及与 HD 相关的、含 103 个多聚谷氨酰胺扩展的亨廷顿蛋白（HTT 基因；htt-103Q）。在 SH-SY5Y 细胞处理或野生型小鼠慢性给药后，也测定了 latrepirdine 对 α-syn 清除和毒性的影响。Latrepirdine 仅保护酵母免受与 α-syn 相关的细胞毒性，且这一作用似乎通过诱导自噬实现。我们进一步报告，latrepirdine 可刺激分化 SH-SY5Y 神经元中 α-syn 的降解，并在慢性给药后减少鼠脑中的 α-syn，同时伴随自噬活性标志物水平的升高。正在进行实验将确定 latrepirdine 在 α-syn 神经病理转基因小鼠模型中消除 α-syn 积累的效用。我们提出，latrepirdine 可能代表一种新型骨架化合物，用于发现强效的促自噬/抗神经退行化合物，经优化其促自噬和促神经发生作用后，可能为突触核蛋白病（包括帕金森病、路易体痴呆、快速眼动（REM）睡眠障碍和/或多系统萎缩）带来临床获益。
引言
Latrepirdine（Dimebon；dimebolin）是一种神经活性化合物，对组胺能、α-肾上腺素能和血清素能受体具有拮抗活性，在实验动物中与增强认知、神经保护和神经发生相关。基于其对啮齿动物认知功能的影响及其高度有利的安全性特征，该化合物已进入阿尔茨海默病（AD）和亨廷顿病（HD）的临床试验。相关报告表明，latrepirdine 通过刺激这些易于聚集的神经退行相关蛋白的分解代谢，保护细胞免受与 Aβ42 或 γ-突触核蛋白相关的细胞毒性。在此，我们试图确定 latrepirdine 是否能保护细胞免受多种神经退行相关蛋白积累相关的细胞毒性，包括 α-突触核蛋白（α-syn）、与肌萎缩侧索硬化相关的基因 TDP43 和 FUS，以及含 103 个多聚谷氨酰胺（polyQ）扩展的 HD 相关亨廷顿蛋白（HTT 基因；htt-103Q）。我们报告，latrepirdine 提高了表达 α-syn 的酿酒酵母（S. cerevisiae）的细胞活力，但对表达 TDP43、FUS 或 htt-103Q 的酵母菌株未提供保护。帕金森病（PD）和 AD 是两种最常见的神经退行性疾病。PD 和 AD 患者均表现为进行性认知功能下降，其原因是致病性不溶性蛋白聚集体积累，先于特定区域的突触和神经元丢失。主要由 α-syn 和泛素组成的细胞内路易体的形成，与 PD、路易体痴呆、快速眼动（REM）睡眠障碍和多系统萎缩的发病机制相关。值得注意的是，30–50% 的 AD 患者在大脑皮层也存在非典型的 α-syn 病理（除经典 AD 神经病理外）。事实上，α-syn 最初被鉴定为 AD 相关老年斑的非 Aβ 成分，后来被确定为路易体的主要成分。
近期研究提示，α-syn 以稳定的螺旋折叠四聚体形式存在，必须先去稳定化才能错误折叠并形成在突触核蛋白病中观察到的纤维状聚集体。我们假设，一种能保护细胞免受 α-syn 相关细胞毒性的化合物，可能为携带突触核蛋白病的患者提供临床获益，包括 PD、路易体痴呆、REM 睡眠障碍、多系统萎缩，以及某些 AD 病例。
迄今为止，最有前景的 α-syn 降解调节剂和抗 α-syn 诱导细胞毒性保护剂是雷帕霉素小分子增强剂（SMER；最著名的是 SMER-28）。最近，SMER-28 被证明可诱导自噬、改善细胞活力并促进神经退行疾病相关蛋白（包括淀粉样前体蛋白代谢产物（其中 Aβ）、htt 和 α-syn）在细胞模型中的清除。在相关研究中，我们报告 latrepirdine 通过诱导哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和 Atg5 依赖的自噬，保护酿酒酵母免受与 Aβ42 积累相关的蛋白质毒性，在哺乳动物细胞系和转基因 CRND8 小鼠脑中也具有同样作用。在此，我们提供证据表明 latrepirdine：（1）保护细胞免受 α-syn 相关细胞毒性；（2）在三种不同模型系统中增强自噬和 α-syn 降解；（3）慢性给药时，在诱导自噬的同时减少鼠脑中的 α-syn 水平。
材料与方法
Latrepirdine 的制备与处理
Latrepirdine 的合成与表征已在此前描述。简言之，latrepirdine 购自 SinoChemexper（中国上海），纯度测定 ≥99%，或由 Medivation（美国加州旧金山）直接提供。体外使用时，latrepirdine 直接溶于培养基至所需浓度，如前所述。体内给药时，latrepirdine 溶于 0.9% 生理盐水（溶媒），终浓度为 3.5 mg/ml（每 2 天新鲜配制）。
酵母生长曲线与点种实验
除非特别说明，酵母细胞均在 30°C 培养。使用 Bioscreen（www.bioscreen.cc）监测酵母菌株的生长。酵母菌株在 2% 棉子糖中预培养，稀释至 OD600 为 0.05，并用 2% 半乳糖诱导。每 1 小时测定一次光密度（OD）。原始数据在独立实验间取平均，并将 OD600 随时间变化绘制成生长曲线。点种实验中，酵母细胞在棉子糖培养基中过夜培养至对数中期。然后将培养物标准化至 OD600 = 5.0，进行 10 倍系列稀释，并点种到含 2% 葡萄糖或半乳糖的相应选择性缺陷培养板上。培养 2–3 天后拍摄培养板照片。
酵母非特异性自噬测定
酵母菌株 YTS158（Daniel J Klionsky 博士馈赠，密歇根大学）在不含或含不同浓度 latrepirdine（如图所示）的培养基中培养至对数中期。然后收获细胞，并按所述用分光光度法测定碱性磷酸酶活性。
SH-SY5Y 细胞培养实验
稳定转染四环素（dox）可诱导（"tet-off"）野生型 α-syn 基因的 SH-SY5Y 细胞，以及过表达 β-半乳糖苷酶基因的对照 SH-SY5Y 细胞（L Stefanis 博士馈赠，雅典科学院生物医学研究基金会基础神经科学部）进行培养和药物处理。详细方法见补充方法部分。
实验动物与药物处理
本研究所有小鼠均维持在 C3H/He-C57BL/6 杂交背景（此处称为"野生型"小鼠）。2 月龄雄性同窝小鼠接受 21 次连续每日一次腹腔注射，分别为 3.5 mg/kg latrepirdine（n = 4）或 0.9% 生理盐水（溶媒；n = 4）。处理后，处死动物并经心脏灌注冰冷磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。解剖大脑并速冻用于生化分析。动物单独饲养，维持 12:12 光暗周期（0700 小时开灯），整个实验期间自由获取食物和水。本文所述所有实验方案均符合 NIH 动物研究指南，并经西奈山医学院机构动物护理与使用委员会批准。详细方法见补充方法。
统计分析
使用 MultiGauge 软件（Fujifilm Life Sciences，美国康涅狄格州斯坦福德）测量免疫反应性蛋白质印迹条带的积分密度，并标准化为对照的百分比（溶媒或非转基因同窝小鼠，如所示）。在所有情况下，使用 Shapiro–Wilk 正态性检验和 Levene 方差齐性检验（Shapiro–Wilk 和 Levene 检验 P ≥ 0.05）以确定是否纳入参数检验。使用独立样本 t 检验（参数设计）或 Mann–Whitney U 检验（非参数设计）确定两组间显著均值差异。t 检验和方差分析的显著性以 P ≤ 0.05 报告，使用双尾检验，α 水平为 0.05。所有统计分析使用 SPSS v18.0（IBM 北美，美国纽约）和/或 GraphPad Prism 5（GraphPad Software，美国加州拉霍亚）完成。