研究简介
蛋白质的进化由序列变异所塑造——例如通过获得或丢失翻译后修饰，这些变异会改变蛋白质的性质。其中，可逆的磷酸化修饰会改变蛋白质整体的电荷状态，使生物体能够动态地响应环境波动。在植物中，气孔（调控气体交换与叶片温度的微观孔隙）的"水主动"开放过程，正是由依赖于磷酸化的信号转导所控制的。本研究鉴定出一种涉及去泛素化酶 UBIQUITIN-SPECIFIC PROTEASE 24（UBP24）的机制，该机制在高温条件下促进拟南芥（Arabidopsis thaliana）的气孔开放。UBP24 可被激酶 OPEN STOMATA 1（OST1）在其第 360 位丝氨酸上磷酸化，而 OST1 则在响应高温胁迫时被 B4 RAF 激酶激活。
这一磷酸化事件能够稳定 UBP24，使其得以对质膜 H⁺-ATPase 进行去泛素化，从而促进气孔开放。这揭示了一条在维管植物中演化形成、用于调控气孔功能的高温响应信号通路。引人注目的是，在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中存在着相似的进化特征：UBP24 的同源蛋白 Ubp3 需要在对应位点上具备一个组成型带负电荷的残基，才能支持热激后的生长。本研究发现揭示了一种保守的分子机制——负电荷（通过磷酸化修饰或酸性残基赋予）能够调节去泛素化酶的功能，从而支撑植物与酵母的适应性热响应，也凸显了基于电荷的调控如何促进胁迫条件下的细胞韧性。
Bioscreen 全自动生长曲线分析仪的应用
构建酵母 S288C 背景的野生型、UBP3 缺失株，以及把 Ubp3 第 691 位谷氨酸（与拟南芥 UBP24 Ser360 对应、天然带负电的位点）替换为丙氨酸的点突变株 E691A；将这些菌株在 YP+5% 葡萄糖培养基中培养至 OD600≈0.1 的统一生理状态，洗涤去糖后重悬于 YP 培养基，各分成两份——一份在 PCMT Thermoshaker 中做高温热激，另一份室温作为对照；热激后将菌液按 1:50 稀释至 150 μl YP5%GLU 培养基中转入 Bioscreen C全自动生长曲线分析仪中，在 20 ℃、25 ℃、30 ℃ 三个恢复温度下连续培养，每 15 分钟自动测定一次 OD600，最长连续监测 5 天，全程中等振幅持续振荡，并设培养基空白对照，数据用配套 BioScreener 软件扣除空白 OD600 后归一化。Bioscreen C全自动生长曲线分析仪提供高通量、无人值守、时间分辨率极高的连续生长动力学数据，直接输出 OD600 生长曲线，衍生出可统计的定量指标——"达到最大生长速率所需时间。
实验结果
本研究鉴定出一条高温诱导气孔开放的信号通路：高温以不依赖 ABA 的方式激活 B4 RAF 激酶，后者激活 OST1，由 OST1 直接磷酸化去泛素化酶 UBP24 的第 360 位丝氨酸（Ser360）。该磷酸化引入的负电荷提升了 UBP24 的热稳定性并抑制其降解——模拟磷酸化的 S360D 可回补 ubp24 突变体高温下的气孔开放缺陷，磷酸化缺陷型 S360A 与催化失活型 C206S 则不能，且将 S360D 导入 ost1-3 同样可回补。稳定后的 UBP24 通过去除质膜 H⁺-ATPase（AHA1）C 端调控域上的 Lys63 泛素化修饰，阻止其内吞与降解，维持质子泵丰度，驱动保卫细胞吸水膨胀、气孔开放以实现蒸腾降温。
跨域比较显示，酵母同源蛋白 Ubp3 在对应位点以保守的 Glu691 提供组成型负电荷，将其改为丙氨酸（E691A）后酵母热激后生长明显变慢（次优温度 20 ℃ 下最显著），且该位点在物种比较与 600 代定向进化中均未变异，提示受强烈纯化选择。计算模型进一步揭示 OST1 具双向调控功能，使高温与 ABA/干旱信号得以整合：高温单独促开孔，高浓度 ABA 则迅速占据主导促关闭。综上，由磷酸化（植物的临时负电荷）或酸性残基（酵母、动物的永久负电荷）赋予的负电荷，通过稳定去泛素化酶、保护质子泵、驱动气孔开放，构成真核生物共有的保守耐热机制。
图1、 高温诱导的UBP24磷酸化促进蛋白质稳定性和气孔开放。a，UBP24 USP结构域示意图及来自两个独立数据集的检测到的磷酸化位点。b，代表性绿色谱系物种的简化系统发育树（分支长度未归一化），标示了单源气孔假说中的关键进化事件。c,d，WT（Col-0）与ubp24突变体在黑暗条件下经21°C或42°C处理后气孔形态（c）及孔隙数量量化结果（d，孔径宽度除以孔长）。d中字母表示Kruskal-Wallis检验后的显著性，P < 2.2 × 10⁻¹⁶，事后Dunn检验。e，黑暗条件下在 21 °C 或 42 °C 下表达 ubp24-1 的 UBP24 变体的气孔开度定量分析。f,g，MD 模拟轨迹（f）和稳态（g）下 UBP24 USP 域的总能量。h，通过热变移实验测定 WT 和 S360D UBP24 USP 域的热响应曲线。h 中的线条和阴影分别表示均值和标准误差。i 表示 WT 和 S360D UBP24 UBP24 USP 域的熔解温度。j、k，使用 GFP 抗体在黑暗条件下于 21°C 或 35°C 处理 1 小时后，对拟南芥中 UBP24 蛋白进行检测的代表性西方印迹（j）和半定量分析（k）。l、m，使用 GFP 抗体在不同时间处理 200 μM 环己酰亚胺（CHX）后，对拟南芥中 UBP24 蛋白进行检测的代表性西方印迹（l）和半定量分析（m）。在 m 中，显示了三个生物学重复样本中的 UBP24 蛋白强度。
图2、RAF激活的OST1在高温条件下对UBP24的Ser360位点进行磷酸化。a,b，共表达裂解cYFP标签GST或OST1与nYFP-UBP24在N. benthamiana叶片中的代表性共聚焦图像（a）以及YFP信号颗粒大小的定量分析（b）。图b中显示了双尾学生t检验的P值。ND表示未检测到信号。c，N. benthamiana叶片经GFP陷阱共免疫沉淀（co-IP）后获得的代表性Western blot结果。d，N. benthamiana叶片中共表达OST1并分别在ABA激活或未激活条件下检测到的UBP24磷酸化位点示意图。e，不同处理条件下UBP24 Ser360磷酸肽强度。括号内数字表示检测到的磷酸肽的定位概率。f，使用体外激酶检测法，重组OST1对UBP24 Ser360磷酸化产生的代表性放射性印迹。g，在黑暗条件下，21°C或42°C时，用UBP24(S360D)补救的ost1-3突变体气孔开度定量分析。每种条件下的气孔数为50，来自两个相似结果的生物学重复中的一个代表性样本。h，在黑暗条件下，21°C或42°C时，表达于raf中的B4支系RAF激酶（raf）、RAF20–YFP或RAF24–YFP的七重敲除突变体气孔开度定量分析。i,j，代表Western blot（i）以及使用基于ATPγS的体外激酶检测法测定高温激活OST1对UBP24磷酸化强度的半定量分析（j）。
相关新闻推荐
1、钙磷酸盐与PMMA骨水泥中纳米颗粒对抗耐药菌株的潜力与机制探讨（三）