2.5. 摇瓶培养
将小球藻在250 mL锥形瓶中的100 mL无菌培养基（初始pH 6.8）上异养和混养培养，在轨道摇床上以150 rpm搅拌速度于28°C培养4天。混养藻细胞在恒定荧光照度880 lx下培养。异养培养在黑暗中进行。两种培养的接种量均为10%（v/v）。培养基未缓冲，并根据Bioscreen数据采用热灭菌（121°C，15分钟）。定期从烧瓶中取样以测定细胞密度和油脂产量，然后用于计算生物质和油脂生产率。
2.6. 生物反应器研究
在6L台式搅拌生物反应器中进行微藻批次培养并优化操作条件。生物反应器通过在121°C下高压灭菌45分钟进行灭菌，并分别装入相应的营养原料（MBM、SW或TS）至3L工作体积。将反应器置于白色荧光灯下，恒定照度为880 lx。微藻培养在28°C、180 rpm和0.7 SLPM（标准升/分钟；2 vvm）通气速率下进行4天。通过酸（盐酸，0.1 N）和碱（氢氧化钠，0.1 N）投加将生物反应器中的pH维持在6.8。通过定期取样和检测监测培养过程中培养基的生化组成变化，包括碳水化合物、氮、酸、甘油和SCOD。当微藻培养达到以对数生长期后稳定吸光度读数为标志的静止生长期时，通过以12,000×g离心15分钟收获全部培养液，并冷冻干燥。然后分析干燥的微藻生物质样品的化学组成和胞内油脂含量。
2.7. 分析方法
2.7.1. 生长分析
通过绘制细胞干重（CDW）值（g·L⁻¹）与相应吸光度（Abs540）读数的标准曲线。为测定CDW，将已知吸光度的藻液在4°C下以12,000×g离心15分钟，用无菌生理盐水（0.85%（w/v）NaCl）洗涤两次，并在80°C下干燥至恒重。获得CDW作为Abs540函数的线性回归拟合，R²值为0.99。使用该回归方程将测得的Abs540值转换为CDW值。将CDW值对时间（小时）作图以获得生长曲线。生物质生产率（mg生物质·L⁻¹·d⁻¹）根据从生长曲线得出的生长速率（mg生物质·d⁻¹）计算。
2.7.2. 小球藻细胞的化学组成
对在6L生物反应器中混养条件下培养的SW和TS小球藻细胞进行近似分析。使用Elementar Vario Max碳氮分析仪根据AOAC官方方法990.03测量总粗蛋白。总碳水化合物和脂肪测量由Dairyland Laboratories Inc.进行。淀粉通过淀粉葡萄糖苷酶/α-淀粉酶方法测量；而纤维和可溶性碳水化合物含量分别使用淀粉酶中性洗涤剂纤维方法和苯酚-硫酸比色法测量。总脂肪使用SoxCap 2047和Soxtec提取系统测量（基于AOAC官方方法920.39粗脂肪乙醚提取法）。灰分含量按照水和废水检验标准方法测定。
2.7.3. 使用高功率超声和有机溶剂提取微藻胞内油脂
使用Branson 450系列台式超声设备（最大输出功率400 W，频率20 kHz）破碎藻细胞。使用的超声细胞破碎探头为锥形微尖钛探头，端面为平头1/8英寸（3 mm）直径。在有机溶剂存在下对冷冻干燥的微藻细胞施加超声波，以机械破坏细胞壁并使溶剂能够提取胞内油脂。所有超声处理在494 μmpp（峰峰值）振幅下进行。溶剂系统由甲醇和甲苯按1:2比例组成。测试了许多其他溶剂，并根据最高提取效率选择了甲醇-甲苯系统。由于与氯仿相关的危害，测试了甲苯作为标准Folch油脂提取方法中氯仿的替代品。将1克干燥生物质与20 mL溶剂系统混合，在70%振幅（494 μmpp）下超声3分钟。在测试了0.5、1、2、3、4和5分钟的时间间隔后选择了3分钟的超声时间。超声过程中将样品置于冰浴中以防止温度升高。每次超声-提取后，添加无水硫酸镁以去除可能存在的水分，并使用Whatman 1号滤纸过滤混合物。用甲苯冲洗滤纸以回收粘附在滤纸上的残留油脂。使用旋转蒸发器在65°C下从滤液中去除溶剂（Buchi rotavapor R124），并通过重量法测定油脂重量。油脂浓度计算为油脂产率百分比（每100 g生物质提取的油脂克数）。从每种培养基获得的油脂生产率（g·L⁻¹·d⁻¹）确定为生物质生产率（g·L⁻¹·d⁻¹）与油脂含量（每克生物质的油脂克数）的乘积，如下所示：PL = CL × ΔCDW / t；其中PL为油脂生产率，ΔCDW为从接种到收获的累积干细胞重量，t为总培养时间，CL为油脂含量。
作为对照，使用标准改良Folch方法测量微藻生物质中的油脂含量（wt.%）。将超声细胞破碎方法的效率与使用相同溶剂系统和同一批微藻生物质的磁搅拌（带玻璃珠）和旋转混合等其他机械剪切技术进行比较。TS的油脂含量通过冷冻干燥1 L TS并使用前述超声-溶剂方法从干燥的酒糟固形物中提取玉米油来测定。SW不含任何油脂，因为它是从脱脂大豆片（去除油脂>99.5%）中提取的。
2.7.4. 胞内脂质的脂肪酸分析
由Dairyland Laboratories Inc.进行油脂样品的脂肪酸分析。脂肪酸通过一步法使用氯仿和甲醇HCl酯化为甲酯。使用配备填充柱和FID（火焰离子化检测器）的Agilent 7820 GC通过气相色谱（GC）检测甲酯。
2.7.5. 生物反应器研究中培养液的化学分析
定期从6L搅拌生物反应器中收集的样品在去除微藻细胞后，分析可溶性糖、酸、乙醇、总氮（粗蛋白）和可溶性COD（SCOD）。使用配备Bio-Rad HPX-87P碳水化合物柱、保护柱和Varian折射率（RI）检测器的Varian高效液相色谱（HPLC）测量大豆糖。样品体积为20 μL；洗脱液为过滤（Millipore尼龙膜过滤器，孔径0.2 μm）并脱气的HPLC级水，流速为0.6 mL/min。柱温为85°C，运行时间为22分钟。使用的标准品为在去离子水中以5 mg·mL⁻¹浓度制备的葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、水苏糖和棉子糖。TS中的可溶性糖、酸和甘油以及MBM中的葡萄糖通过配备Waters 401型折射率检测器、柱加热器、自动进样器和计算机控制器的水相高压液相色谱仪测量。使用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱（300×7.8 mm），以0.012 N硫酸为流动相，流速0.8 mL/min，进样量20 μL，柱温65°C。总粗蛋白按前述方法测量。培养上清液中的SCOD使用Hach COD试剂盒测量。TS中的总固形物和悬浮固形物按照水和废水检验标准方法测量。
2.8. 统计分析
使用JMP 8.0.2进行方差分析（ANOVA），以确定不同处理之间的显著差异。通过Student's t检验在p=0.05水平计算最小显著差异（LSD）。所有处理均进行两次重复，结果以两次重复的平均值±标准差（SD）表示。
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