摘要
弧菌属（Vibrio）的代谢多样性、可操作性和快速生长潜力使其成为研究海洋环境中碳循环的越来越有吸引力的系统。本研究采用计算机辅助的减法蛋白质组学策略，鉴定了一种新型101 kDa的GH3家族β-糖苷酶（LamN），该酶存在于能够利用藻类储存葡聚糖海带多糖（laminarin）的发光哈维氏弧菌（Vibrio campbellii）菌株中。异源过表达系统验证了LamN的序列预测功能，因为它使大肠杆菌（Escherichia coli）能够以海带多糖作为唯一碳源生长。定量逆转录PCR分析显示，与在葡萄糖或甘油上生长的相同菌株相比，在海带多糖上生长的坎氏弧菌（V. campbellii）的lamN基因表达诱导了4至314倍。相应的串联质谱分析仅在海带多糖上生长的细胞中检测到LamN蛋白表达。异源表达、纯化和生化特征鉴定表明，LamN是一种热稳定的海带多糖酶，具有β-1,3、β-1,4和β-1,6糖苷酶活性。总之，这些数据鉴定了一种酶，它可能使V. campbellii能够利用与衰亡浮游植物水华相关的一些最丰富的多糖，并支持V. campbellii可能参与发光"乳海"（milky seas）的形成。
引言
弧菌属成员能够进行壮观的代谢化学反应和宿主关联，但这些异养生物在海洋有机碳循环中的作用，特别是在沿海环境中，很可能被低估了。这部分是由于观察到弧菌属是表层水群落中相对低丰度的组成部分。然而，弧菌属也能够对营养脉冲做出快速响应，在改良的微宇宙中爆发性生长，并在环境浮游植物水华期间快速增殖，这表明在试图确定它们对有机大分子回收的总体贡献时，也应考虑短暂的弧菌水华。
尽管关于弧菌介导的生物转化和再矿化过程中涉及的分子成分和机制的细节相对较少，但最近的努力已开始阐明其中一些过程的遗传基础，并已成功地利用这些异养生物作为酶的来源，用于藻类的分解代谢。
在更大的背景下，沿海地区每年周期性发生的浮游植物水华已成为理解海洋碎屑循环生物化学的重要生态系统，特别是参与初级生产者海洋碎屑中复杂碳水化合物回收的细菌的碳水化合物代谢酶响应。然而，这类研究大多局限于温带环境。对热带环境中浮游植物水华的了解要少得多；特别是那些负责独特环境现象——发光"乳海"的水华。发光"乳海"的特点是大陆架或沿海表层水持续且大量的光发射，可跨越数千平方公里并持续数天。有限的证据表明两种海洋微生物与乳海的形成有关：发光细菌哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）和光合单细胞藻类球状棕囊藻（Phaeocystis globosa）。然而，对V. harveyi的推定鉴定仅基于营养特性。由于哈维氏弧菌进化枝的成员具有几乎无法区分的表型，传统的表型鉴定方法经常导致错误鉴定。因此，发光姐妹种如坎氏弧菌（V. campbellii），通常被误鉴定为V. harveyi，不能被正式排除为乳海中的发光细菌伙伴。
棕囊藻属（Phaeocystis）在海洋碳循环中发挥着重要作用，据估计它们负责约10%的全球年度初级生产力，因为它们能够在营养丰富的沿海和海洋水域形成大规模水华。在这些水华期间，棕囊藻产生的细胞有机碳至少40%以细胞内储存多糖海带多糖的形式存在，特别是金藻昆布多糖（chrysolaminarin），一种可溶的β-1,3-葡聚糖，带有β-1,6连接的葡萄糖分支。一般来说，由不等鞭毛类（Stramenopile）产生的海带多糖是微生物环最丰富的碳源之一，利用它们所需的酶在海洋环境中广泛分布。鉴于在球状棕囊藻水华衰亡期间大量释放海带多糖、粘多糖和脂质，有人假设，当这种释放的富含营养的浮力碎屑作为基质物理限制弧菌细胞时，发光乳海就会形成，从而同时提供支持爆发性生长所需的营养环境和使局部自诱导剂浓度足以诱导生物发光的空间环境。确实，这种生长是爆发性的，因为对乳海的唯一卫星遥感观测估计总发光细菌种群包含约4×10²²个细胞。
虽然先前的研究已从北海沿海以球状棕囊藻为主的浮游植物水华中分离出不发光的弧菌，并从西阿拉伯海发光乳海中的棕囊藻群落中分离出发光弧菌，但负责潜在利用海洋碎屑中藻类碳水化合物（如海带多糖）的弧菌酶尚未被描述。在本研究中，我们鉴定并表征了一种新型糖苷水解酶家族3 β-糖苷酶（LamN），它存在于能够利用海带多糖作为唯一碳源支持爆发性生长的发光坎氏弧菌菌株中。
材料与方法
细菌菌株与生长
12株先前表征的坎氏弧菌菌株（ATCC BAA-1116、HY01、E1、501J、602L、9078-83、2SA4、42A、ATCC 25920、CAIM 115、CAIM 198和CAIM 1500）和16株哈维氏弧菌菌株（ATCC 33843、G1、H6、2415-05、ATCC 14126、ATCC 35804、CAIM 463、CAIM 606、CAIM 1075、CAIM 1766、74F、CAIM 1792、L1、9567-98、CAIM 148和CAIM 1754）在26°C下于M9最小培养基（1.1% 5×M9最小培养基盐、1.5% NaCl、2 mM MgSO₄、0.1 mM CaCl₂，pH 7.8）中生长，以0.4%葡萄糖、甘油或海带多糖作为唯一碳源。用于标准DNA克隆和蛋白质表达操作的大肠杆菌BL21(DE3)（Life Technologies）和Tuner (DE3)（EMD Millipore）在LB培养基中生长。使用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪（Growth Curves USA）生成细菌生长曲线。简言之，将过夜培养物稀释至5×10⁵细胞/mL，每株菌株取三个200 μL等分试样转移至100孔蜂窝板中。平板在26°C下连续振荡孵育48小时。每小时进行宽波段OD450-580 nm测量，并进行三次独立实验。
lamN同源物的PCR筛选和定量逆转录PCR（qRT-PCR）
使用三组引物[Vbg-5L (5′-ATATGGCGTGGC TAAACACC-3′)/Vbg-5R (5′-GATTGATCGCCAGAAACGAT-3′)；Vbg-3L (5′-TGCAACGCTCTGCTATGAAT-3′)/Vbg-3R (5′-TGCGTTTCTT CACTTGGTTG-3′)；Vbg-ML (5′-CCCGTCAGGTATTCGTATGG-3′)/Vbg-MR (5′-GCACCCAACTCTTCACCAAT-3′)]对26株弧菌菌株进行lamN筛选，扩增条件如下：95°C 45秒、54°C 45秒、72°C 45秒，共40个循环，最后在72°C延伸10分钟。PCR扩增子通过1.2% FlashGel DNA盒（Lonza）电泳进行大小确认。本研究鉴定的7个全长坎氏弧菌lamN基因序列已存入GenBank。
从在M9最小培养基加葡萄糖、甘油或海带多糖中26°C、200 rpm恒定振荡培养至中期的细菌培养物（3.0×10⁸细胞/mL）中取等分试样进行总RNA提取。使用Aurum Total RNA Mini Kit（Bio-Rad Laboratories Inc.）按照制造商说明分离RNA，并用DNase处理两次。实时逆转录PCR测定在iCycler（Bio-Rad Laboratories）上进行，使用iScript OneStep RT-PCR Kit with SYBR Green（Bio-Rad Laboratories）。实时PCR反应混合物包含来自每个提取样品的10 ng总RNA、200 nM引物VgluF-475（5′-ACTGCAGAAGAAGCGGACAT-3′）和VgluR-592（5′-GATTGCCTTCGATGGTGTTT-3′），并置于以下循环条件：50°C 30分钟和95°C 15分钟1个循环，随后94°C 15秒、52°C 30秒、72°C 30秒，共40个循环。用于计算转录本数的标准曲线通过扩增含lamN的pET-22b质粒的系列稀释液制备。所有菌株在每种碳源中培养三次，并以这种方式进行测试。