好氧生长测定
所有生长测定使用Bioscreen C（Oy Growth Curves Ab Ltd., Helsinki, Finland）进行，设三个或四个生物学重复。携带含目的MFS转运体pRS316质粒的酿酒酵母菌株单菌落在oMM-Ura加2%葡萄糖中于30°C在24孔板中培养至对数生长晚期。培养物在4000 rpm下离心，弃去培养基上清，细胞重悬于H₂O中。测量OD以计算接种量，使Bioscreen板中200 μL培养物的初始OD约为0.1或0.2，培养基为oMM。在30°C下每隔30分钟测量600 nm处的OD，持续48-96小时。
落射荧光显微镜
表达转运体的D452-2细胞在oMM-Ura加2%葡萄糖培养基中于30°C培养至对数生长中期。培养物离心后点样到载玻片上，在Leica DM 5000B落射荧光显微镜上以100× DIC（Leica, Germany）观察。使用L5滤光块观察转运体；图像使用Leica DFC 490相机捕获，并使用随附的显微镜软件分析。
基于酵母细胞的糖摄取实验
用pRS316-CDT1、pRS316-CDT2或pRS316-ST转化的酵母菌株D452-2细胞培养至对数生长中期。收获细胞，用转运实验缓冲液（5 mM MES，100 mM NaCl，pH 6.0）洗涤两次，并重悬至终OD600为40。将500 μL细胞重悬液与等体积含400 μM相应糖的转运实验缓冲液快速混合（最终糖浓度约为200 μM）。对于初始时间点（t = 0秒），取一份样品在4°C高速离心1分钟以沉淀细胞，去除上清。剩余细胞重悬液在30°C下以恒定摇动孵育30分钟。孵育后，样品在4°C下以14000 rpm离心5分钟，去除上清。分析时，将400 μL上清与100 μL 0.5 M NaOH混合，使用Dionex ICS-3000 HPLC测量上清中剩余的糖浓度，如下所述。
HPLC分析
HPLC分析在Dionex ICS-3000 HPLC上进行，使用CarboPac PA200分析柱（150 × 3 mm）和CarboPac PA200保护柱（3 × 30 mm），室温。进样25 μL样品，以0.4 mL/min流速运行，流动相使用0.1 M NaOH。使用乙酸盐梯度分离木糖糊精样品。对于木二糖和木三糖，乙酸盐梯度如下：0 mM保持1分钟，8分钟内升至80 mM，然后在1分钟内升至300 mM，保持此浓度2分钟，随后平衡回到0 mM，持续3分钟。
CRISPR-Cas9基因组编辑
CRISPR-Cas9基因组编辑按照已发表的程序进行，略有修改。简言之，Cas9转化混合物由90 μL酵母感受态细胞（OD600约1.0）、10.0 μL 10 mg/mL ssDNA（D9156, Sigma, St. Louis, MO）、1.0 μg pCAS质粒、5.0 μg线性修复DNA和900 μL聚乙二醇2000（295906, Sigma）、0.1 M乙酸锂、0.05 M Tris-HCl和5.0 mM EDTA组成。混合物在30°C孵育30分钟，然后在42°C热激17分钟。热激后，细胞在5000 rpm下离心2分钟。沉淀重悬于250 μL YPD中，在30°C恢复2小时，然后全部内容物涂布到YPAD+G418平板（20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L琼脂、0.15 g/L腺嘌呤半硫酸盐、20 g/L葡萄糖和200 mg/L G418）上。细胞在37°C生长24小时，然后转移到30°C完成生长。从YPAD+G418平板挑取菌落，在1.0 mL液体YPAD培养基中过夜培养。使用MasterPure酵母DNA提取试剂盒（MPY80200, Epicentre）从这些培养物中提取基因组DNA。进行PCR确认整合等位基因，并将PCR产物提交至UC Berkeley测序设施（Berkeley, CA）进行Sanger测序以确认整合。
使用荧光发射光谱测定蛋白质表达水平
为了比较质粒编码和染色体整合基因的ST16表达，细胞在10 mL SC-Ura培养基（Sunrise Science Products）中于30°C好氧条件下在1%葡萄糖中过夜培养。使用葡萄糖而非XD，因为细胞在含XD培养基中生长非常缓慢。细胞归一化至200 μL中总OD为20.8，并使用Synergy Mx酶标仪（BioTek）测量GFP荧光信号，滤光片设置如下：激发485/20，发射528/20。表达无GFP融合的ST16的细胞用作对照，以确定酵母的基线荧光信号。
为了比较质粒的转运体表达（图S5），50 mL培养物在30°C下生长至OD600达到3，此时通过离心收获细胞，重悬于约4-5 mL培养基中，并分装到微量离心管中，使总OD600为30。样品在14,000 rpm下离心1分钟，吸去上清。细胞沉淀在液氮中快速冷冻。冷冻细胞沉淀在冰上解冻，加入400 μL缓冲液A（25 mM Hepes、150 mM NaCl、10 mM纤维二糖、5%甘油、1 mM EDTA、0.2× HALT蛋白酶抑制剂混合物（ThermoFisher, Waltham, MA），pH 7.5）重悬。使用Mini-Beadbeater-96（Biospec Products, Bartlesville, OK）用锆/硅珠裂解细胞。细胞碎片在4°C下以10,000×g离心10分钟，裂解物用缓冲液A稀释三倍，并使用Horiba Jobin Yvon Fluorolog荧光计（Horiba Scientific, Edison, NJ）测量其GFP荧光。λEX为485 nm，发射波长记录范围为495-570 nm，激发和发射狭缝宽度均设为3 nm。用从大肠杆菌纯化的eGFP（>95%纯度）制备荧光校准曲线。选择设置和eGFP蛋白浓度范围，使最大λEM（510 nm）处的荧光强度与标准品蛋白浓度之间呈线性相关。样品的最大荧光强度在此范围内。目标蛋白浓度代表3个生物学重复的平均值。裂解物的总蛋白浓度使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒测定。
系统发育分析
MFS转运体的系统发育树使用Phylogeny.fr平台构建，并使用本研究中使用的转运体的氨基酸序列。
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