摘要
鼠李糖乳杆菌是一种著名的乳酸菌，但最近首次从商业益生菌粉末中分离出新菌株ZY。尽管许多研究致力于开发成本效益高的培养基用于乳酸菌生产，但de Man、Rogosa和Sharpe（MRS）培养基仍然是生物过程中最常用的培养基。本研究旨在基于统计方法解析MRS的组成，以获得更高的乳杆菌生物量。在田口方法中，采用L27正交阵列评估MRS中10种成分的显著性，根据其对OD600生物量的影响排序为：葡萄糖 > MnSO4·H2O > 牛肉浸膏 > CH3COONa > MgSO4 > 酵母浸膏 > 蛋白胨 > K2HPO4 > 柠檬酸铵 > Tween 80。尽管统计分析后MRS中柠檬酸铵、K2HPO4、CH3COONa和MgSO4等单个微量元素对生物量影响不显著，但完全去除微量元素会显著影响乳杆菌的细胞生长。通过衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）和SDS-PAGE结合串联质谱的蛋白质鉴定进一步表征细胞特性，表明MRS中作为主要碳源的葡萄糖对鼠李糖乳杆菌的生产起着最关键的作用。
引言
益生菌被世界卫生组织（WHO）定义为“当摄入足够量时，对宿主健康有益的活微生物”。大多数益生菌包括乳酸菌，主要选自乳杆菌属和双歧杆菌属，它们是健康促进细菌，构成平衡肠道微生物群的主要部分。供人类消费的乳酸菌主要存在于发酵乳、奶酪、果汁、葡萄酒和香肠中。益生菌或乳酸菌通过多种机制发挥作用，包括调节参与小肠黏膜免疫反应、炎症和凋亡的人类基因表达，以及肥大细胞中过敏相关激活。此外，许多分子被认为参与宿主信号传导，如分泌蛋白、细胞壁成分或从细胞包膜突出的菌毛。
通常，乳酸菌具有多种氨基酸和维生素营养缺陷。据信，为乳酸菌开发丰富复杂的培养基将导致选择与其生物位点密切相关的特定营养缺陷。著名的乳酸菌乳杆菌可在多种复杂培养基中发酵，包括植物材料和液体培养基如MRS培养基，或在化学成分确定培养基（CDM）中。其中，MRS培养基在乳杆菌培养中应用最广泛。尽管许多研究人员证明乳杆菌在MRS中生长良好，但尚未有实验设计评估MRS中10种特定成分对细胞生长、蛋白质和其他因素的影响。先前研究表明，发酵特性（包括生长培养基、发酵温度和pH）影响生物量产量以及乳杆菌的表面特性。然而，关于MRS成分对益生乳杆菌生产过程和行为影响的知识有限。
传统上，发酵过程使用一次一因素策略进行优化。这种方法相对简单，不需要繁琐耗时的统计分析；然而，该策略无法分析两个或多个因素之间发生的相互作用。为消除这些缺点，田口方法被应用于确定发酵培养基的最佳参数，因为它仅使用实验可能因素组合的一小部分，并显示出令人满意的结果。
在本研究中，从商业益生菌产品中分离出一株乳酸菌。通过基于16S rRNA序列系统发育树鉴定，该菌株被归类为鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus ZY）。由于已知培养基组成是发酵过程的关键因素，设计合适的发酵培养基是提高产物产量的有效方法。据我们所知，目前尚无关于MRS培养基成分对乳杆菌发酵影响的报告。这是首次尝试建立正交实验设计（L27）以筛选显著变量，随后使用Box-Behnken实验设计获得MRS培养基的最佳组成。此外，为考虑生长、蛋白质和益生能力之间可能的相关性，进行SDS-PAGE分析和FTIR以更好地理解影响鼠李糖乳杆菌生长的MRS培养基成分。
材料与方法
益生菌的分离与鉴定
通过16S rRNA测序方法使用通用引物27f和1525r分析分离菌株的鉴定。从台湾商业益生菌胶囊中分离出一株细菌菌株，命名为鼠李糖乳杆菌ZY。该菌株的16S rRNA序列已存入GenBank数据库，登录号为KC012630。
菌株和培养条件
储备培养物保存在4°C的MRS琼脂平板上，每月转接至新鲜培养基。为制备接种物，将MRS琼脂上的培养物在MRS肉汤（g/L）中传代培养12小时，温度为37°C：葡萄糖20，酵母浸膏5，KH2PO4 2，乙酸钠5，MgSO4·7H2O 0.05，MnSO4·H2O 0.05，柠檬酸铵2，牛肉浸膏10，蛋白胨10，葡萄糖1。
细菌生长监测
使用Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪和微孔板监测细胞密度。在600 nm波长下读取光密度（OD）。将接种培养基以350μl体积无菌分配至蜂窝微孔板（10 x 10）中，并将等体积未接种培养基无菌分配至微孔板中作为对照以确定可能污染。微孔板立即在Bioscreen C系统中于37°C孵育25小时。时间进程每30分钟在线监测一次。每个实验重复三次。
生长动力学分析
根据Zwietering等人修改的Gompertz方程对生长数据进行建模，形式为γ=k+A exp{-exp[(μmax e/A)(λ-t)+1]}；其中γ是时间t时的生长程度，以log CFU/mL表示；k是初始细胞密度，以log CFU/mL表示；A表示接种和稳定期之间细胞密度的差异；μmax是最大生长速率，以△log CFU/mL/h表示；λ是以小时表示的潜伏期长度，t是时间。通过SigmaPlot 10.0的非线性回归程序对实验数据进行建模。
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