摘要
以活性污泥为接种物，在含甲硫醇的无机盐培养基中富集并分离得到一株能够降解甲硫醇的细菌。通过Biolog测试和16S rDNA测序，将该分离菌株鉴定为多粘类芽孢杆菌CZ05。该菌株能够利用有机和无机培养基，在pH 4至9范围内生长良好。批次培养实验表明，该菌株在4号培养基中比1号培养基中降解甲硫醇效果更好。采用以火山岩为载体的串联运行生物滴滤池，测试了多粘类芽孢杆菌CZ05在模拟沼气中去除甲硫醇的应用效果。长期实验表明，在空床停留时间30秒条件下，生物滴滤池可高效去除高浓度甲硫醇（60 ppm），去除率达99.5%。硫化氢的加入会降低甲硫醇去除率，因为溶解氧与甲硫醇存在竞争关系。
1. 引言
近年来，沼气在热电联产厂、内燃机和燃料电池中的能源利用受到越来越多的关注。农村沼气池、垃圾填埋场和污水处理厂通过厌氧消化可生物降解物质产生的沼气中，可能含有挥发性有机硫化合物，如甲硫醇、乙硫醇、丙硫醇、羰基硫、二甲基硫和二甲基二硫等。在这些化合物中，甲硫醇含量最丰富，约为5–10 ppm。挥发性有机硫化合物的存在会造成环境问题，因为它们被氧化成二氧化硫，而二氧化硫是酸雨的主要原因。甲硫醇作为挥发性有机硫化合物中含量最丰富的化合物之一，常被选为代表性化合物用于生物去除研究。
挥发性有机硫化合物的生物降解因其成本低、与其他化学或物理方法相比具有独特优势而受到重视。已有研究调查了厌氧废水中硫化氢的生物去除、除臭以及能源气体的净化。尽管这些系统能够实现硫化氢的精确去除，但甲硫醇不能被有效去除。近期已开发出一种改进的三步生物技术工艺用于去除甲硫醇。该工艺包括将甲硫醇从气相萃取到含碳酸盐的溶液中，甲硫醇在厌氧生物反应器中降解为硫化氢、二氧化碳和甲烷，以及硫化氢部分氧化为单质硫。在该工艺中，甲硫醇在厌氧生物反应器中被生物降解；同时在好氧反应器中被化学氧化为二甲基硫和二甲基二硫。甲硫醇在好氧生物反应器中被生物降解的工艺也可以同时降解二甲基硫和二甲基二硫。
随着大气有害气体排放严格法规的建立，对能够用于构建甲硫醇去除生物滴滤池的甲硫醇利用微生物的需求日益增加。这种滤池应适用于处理来自沼气池、垃圾处理场和污水处理厂的沼气。本研究介绍了能够利用甲硫醇作为碳源和能源的细菌的分离、鉴定和特性研究，以及其在生物滴滤池中处理含甲硫醇模拟沼气的应用。
2. 方法
2.1 培养基
采用无机盐培养基富集和分离甲硫醇利用菌。培养基成分如下（g/L）：磷酸氢二钾 2.00；磷酸二氢钾 2.00；氯化铵 0.4；硫酸镁 0.20；七水硫酸亚铁 0.01；五水硫代硫酸钠 8.00；微量元素溶液 2 mL/L（固体培养基加琼脂15 g/L）。最终pH调至7.0。微量元素溶液按照标准方法配制。
选择四种培养基研究菌株利用碳源的特性。1号培养基为上述无机盐培养基。2号培养基用酵母提取物（2.0）代替1号培养基中的五水硫代硫酸钠8.00。3号培养基用葡萄糖2.0代替1号培养基中的五水硫代硫酸钠8.00。4号培养基在1号培养基中添加葡萄糖1.0，并将五水硫代硫酸钠减至2.0。
2.2 CZ05菌株的富集与分离
以天津市东江污水处理厂活性污泥为接种物，在250 mL锥形瓶中加入100 mL 1号培养基，30°C富集甲硫醇利用菌。首次培养甲硫醇浓度较低（0.01%，w/v），最后一批为0.1%（w/v）（间隔0.015%），以甲硫醇为唯一碳源。接种物在30°C培养3天后，转接至下一培养基。经过六次连续转接后，将富集培养物划线于由无机盐培养基和1.5%（w/v）琼脂组成的平板上，在含甲硫醇气相（5 mL甲硫醇，10%）的密封罐中30°C培养约3天。从平板上挑取生长最快的菌落，通过三区划线法接种于相同组成的新平板上进行纯化。在三区平板上观察到生长后，显微镜检查确定菌落纯度。纯化菌株（CZ05）保存于4°C试管斜面中。
2.3 CZ05菌株的鉴定
在显微镜（Olympus BX51，日本）下观察CZ05的细胞形态。按照《伯杰氏鉴定细菌学手册》（第八版）测定其生理生化特性。首先通过Biolog测试（Biolog ML4320，美国）鉴定试管斜面保存的纯培养物，然后进行16S rDNA测序。从菌株培养物中分离染色体DNA，作为16S rDNA PCR扩增的模板。所得产物克隆于质粒pET-22中并进行测序。
2.4 甲硫醇检测
气相中甲硫醇浓度采用气相色谱仪（GC，Agilent 7890，美国）测定，液相中甲硫醇采用GC联用顶空进样器（Agilent G1888）测定。标准甲硫醇氮气（30 ppmv）购自北京Q&Q科技有限公司。标准甲硫醇丙二醇溶液（10% w/w）由上海翔杰香料厂提供。样品在HP-5毛细管柱（Agilent，美国，30 m × 0.25 mm内径 × 0.25 μm膜厚）中分离。气相进样1 mL，顶空进样标准体积，分流比1:1。GC柱温程序设定为70°C保持10分钟。
检测液相中甲硫醇时采用顶空法。将5 mL含甲硫醇样品置于20 mL顶空GC样品瓶（Agilent，美国）中。顶空进样器高样品振荡器条件为：样品瓶压力14 psi，每瓶提取两次，烘箱温度60°C，环温度75°C，传输线温度85°C，样品瓶平衡15分钟，加压0.1分钟，环填充0.15分钟，环平衡0.05分钟，样品进样1分钟，GC循环15分钟。
为获得液相中甲硫醇的校准曲线，选择2000、1600、1200、800、400、200和100 ppm甲硫醇作为标准样品，通过顶空进样器进样。气相中甲硫醇浓度采用气密注射器直接进样气相色谱法测定。选择30、25、15、10、5、2和0.5 ppmv甲硫醇浓度作为数据点，获得气相中甲硫醇的校准曲线。所得校准曲线为A = 9959.9C（液相）和A = 394.6C（气相）。两条校准曲线的相关系数均大于0.99，因此均适用于甲硫醇检测。
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