2.4RTP最低抑菌浓度（MIC）的测定
RTP对受试病原菌的MIC通过肉汤大稀释法测定。将受试病原菌接种于20mlLB培养基中，补充稀释后的提取物，最终浓度范围为0.1至3.0mg/ml，在最适温度下培养24h。培养前后，用分光光度计在600nm波长处测定培养基的吸光度。MIC定义为显示受试菌株可见生长抑制的最低RTP浓度。选择亚MIC浓度用于评估抗生物膜和抗QS活性。
2.5群体感应抑制实验
采用标准纸片扩散法，使用生物监测菌株紫色色杆菌026检测RTP的抗QS活性。紫色色杆菌026在补充0.75%琼脂的LB培养基中生长，并添加20mg/ml卡那霉素。将5ml熔化的LB琼脂（0.75%w/v）与200μl过夜培养的紫色色杆菌026及5ml40mMC6-HSL（作为外源AHL来源）混合，然后轻轻混匀并立即倒在已固化的LB琼脂平板上作为覆盖层。将20μl待测RTP移液至无菌纸片上，纸片放置在固化琼脂上。20μl去离子水作为阴性对照。载有20μl50mg/mlC10-HSL（N-癸酰基-L-高丝氨酸内酯，DHL）的纸片用作阳性对照。平板在28°C过夜培养，观察紫色杆菌素产生。QS抑制通过纸片周围出现无色、不透明但可存活的晕圈来检测。
对于紫色杆菌素产生的定量测定，将紫色色杆菌026接种于4mlLB培养基中，在28°C培养18h。将培养物用含40nMN-己酰基-L-高丝氨酸内酯（C6-HSL）和一系列不同浓度RTP（分别为0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.6mg/ml和1.2mg/ml）的新鲜LB培养基按1:50稀释。不含RTP的样品作为对照，然后在28°C培养48h。涡旋试管以重悬任何贴壁细胞层，将300μl每种培养物置于1.5ml微量离心管中。采用先前描述的方法并略有修改提取紫色杆菌素。通过加入150μl10%十二烷基硫酸钠（SDS）裂解细胞，然后用涡旋混合器混合10s。通过加入600μl水饱和丁醇从细胞裂解液中提取紫色杆菌素，涡旋5s，12000rpm离心5min。将含紫色杆菌素的丁醇相（上层）转移至96孔微量滴定板中，每孔150μl提取液。然后用酶标仪在585nm处分析提取液。根据紫色杆菌素产生的相对水平评估RTP的效果，对照值设为100%。
2.6群游运动抑制实验
将5μl熔化的软顶层琼脂（0.6g琼脂、2.0g胰蛋白胨、1.0g酵母提取物粉末、1.0g氯化钠、200ml去离子水）与最终浓度分别为80mg/ml、160mg/ml、320mg/ml和640mg/ml的RTP混合，然后立即倒在已固化的LB琼脂平板上作为覆盖层。平板中心点接种大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1的过夜培养物。覆盖琼脂固化后，在37°C培养30h。观察细菌的游动和群游区域，测量大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1在不同浓度RTP下培养30h后的迁移距离。所有实验均进行三次重复，数据以平均值±标准差表示。
2.7生物膜形成实验
使用常规96孔微量滴定板进行生物膜形成的定量测定，方法如前所述，略有修改。将过夜培养的受试菌大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1按1:100接种于LB培养基中。将95μl稀释培养液加入无菌圆底96孔微量滴定板的每个孔中。为评估RTP对生物膜形成的影响，向这些培养悬液中加入5μlRTP。用加入95μlLB培养基的5μl去离子水作为对照。平板在37°C静置培养24h。培养后，去除悬液培养物（吸取50μl悬液培养物用于在LB琼脂平板上测定总生物量），用去离子水洗涤平板3次。每孔用125μl0.3%结晶紫染色15min。通过用去离子水洗涤平板3次去除多余染料。用200μl95%乙醇溶解与附着生物膜相关的染料。将每孔的结晶紫/乙醇溶液（125μl）转移至光学透明平底96孔微量滴定板的单独孔中，在595nm处测定OD值。每个数据点取四个重复孔的平均值，并计算标准误差。
2.8共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析
如前所述，在CLSM（LeicaTCSSP2；LeicaMicrosystems，德国海德堡）下监测生物膜。将过夜培养的受试菌株在LB培养基中稀释至最终密度为1.0×10⁶CFU/ml。将1ml补充有640mg/mlRTP的细胞悬液和一片塑料盖玻片（厚0.2mm，直径13mm）分配至24孔微量滴定板的孔中，以不含RTP的1ml细胞悬液作为对照。平板在37°C静置培养48h。对塑料盖玻片上形成的生物膜进行CLSM观察。培养结束后，用无菌蒸馏水轻轻洗涤盖玻片，并按照制造商说明用LIVE/DEADBacLight细菌活力试剂盒（Invitrogen，美国）染色。染色的盖玻片用无菌蒸馏水轻轻洗涤两次，然后用CLSM观察。使用Leica共聚焦软件分析生物膜图像，该软件允许收集z-stack三维重建图像。从盖玻片上侧生物膜形成的随机位置获取图像。还直接从共聚焦堆叠图像测定生物膜厚度。
2.9统计分析
结果以平均值±标准差（SD）表示。进行方差分析，使用SPSSV16.0程序通过单因素方差分析和Tukey检验测试变量间差异的显著性。P<0.05被认为具有统计学显著性。
3.结果与讨论
3.1RTP成分分析
RTP的组分含量总结于表1。数据证实RTP富含多酚（87.52%）和黄酮（61.03%）。通过HPLC分析鉴定了RTP中存在的10种多酚，包括没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯、槲皮素、苯甲酸、槲皮素葡萄糖苷、单宁和山奈酚，含量分别约为8.32%、8.08%、18.08%、13.10%、2.80%、3.66%、6.88%、0.38%、3.44%和0.81%（图1，表1）。RTP中除苯甲酸外的所有多酚化合物均被报道具有抗QS和/或抗生物膜活性。
图1RTP活性成分鉴定的HPLC色谱图。（A）10种标准多酚的HPLC色谱图。峰：（1）没食子酸；（2）儿茶素；（3）表儿茶素；（4）表没食子儿茶素没食子酸酯；（5）表儿茶素没食子酸酯；（6）槲皮素；（7）苯甲酸；（8）槲皮素葡萄糖苷；（9）单宁；（10）山奈酚。（B）RTP多酚的HPLC色谱图。
| 表1 HPLC分析鉴定的RTP成分 | |||
| 峰号 | 多酚化合物 | 保留时间（min） | RTP含量（%） |
|---|---|---|---|
| 1 | 没食子酸 | 9.845 | 8.320 |
| 2 | 儿茶素 | 28.085 | 8.084 |
| 3 | 表儿茶素 | 32.242 | 18.080 |
| 4 | 表没食子儿茶素没食子酸酯 | 37.044 | 13.102 |
| 5 | 表儿茶素没食子酸酯 | 39.472 | 2.804 |
| 6 | 槲皮素 | 42.930 | 3.664 |
| 7 | 苯甲酸 | 45.165 | 6.882 |
| 8 | 槲皮素葡萄糖苷 | 51.204 | 0.384 |
| 9 | 单宁 | 53.944 | 3.439 |
| 10 | 山奈酚 | — | 0.814 |
| — | 总多酚（Folin-Ciocalteu法） | — | 87.52（875.2mgGA/g） |
| — | 总黄酮（Wu等方法） | — | 61.03 |
为确保多酚是否对RTP的抗QS活性负责，我们通过加入饱和中性醋酸铅溶液完全去除RTP中的多酚，并通过加入盐酸（0.8M）回收多酚。使用报告菌株紫色色杆菌026的纸片扩散法表明，前者（去除多酚）不具有抗QS活性，而后者（回收多酚）表现出明显的抗QS活性（图2）。该观察结果证实RTP的抗QS活性与多酚有关。
图2当向RTP中加入足量饱和中性醋酸铅时，产生黄绿色沉淀，表明多酚的存在（A）；通过足量饱和醋酸铅去除多酚的RTP在紫色色杆菌026中无抗QS活性（B）；RTP沉淀经0.8M盐酸回收后，其抗QS活性效果重新出现。
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