1.2.1.2rdrA敲除菌株构建
分别使用rdrA-SY-F/R、rdrA-XY-F/R引物扩增F44基因组rdrA基因上下游各1000bp左右同源臂,以pCS1966质粒为载体,使用BamHI和HindIII酶切位点连接至载体上。用同源重组双交换原理敲除靶标基因，通过含有5-氟乳清酸的合成培养基筛选得到rdrA缺失型菌株，使用rdrA-NB-F/R、rdrA-XJ-F/R引物进行菌落PCR并进行琼脂糖凝胶电泳验证。设计引物如表2所示。
表2rdrA敲除菌株构建引物序列
1.2.2表型检测
1.2.2.1生长曲线和pH曲线
F44、DeltardrA和FrdrA菌株连续活化3代后,按体积分数1%的接种量接种于100mL液体种子培养基中，30℃静置培养,每2h混匀菌液并取样,测定600nm波长处的吸光度OD_{600~{}nm}和pH值,绘制生长曲线和pH曲线。
1.2.2.2Nisin耐受
称取1000IU/mg的NisinZ标准品溶于化开的固体种子培养基,制备得到含10000IU/mL的Nisin固体种子培养基。将活化3代后的F44和DeltardrA菌株培养8h,调整OD_{600~{}nm}至一致,等浓度梯度稀释后将10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀释菌液各吸取10μL依次在平板上点样，30℃下培养2~3d，观察菌落生长情况。
1.2.2.3酸耐受
检测F44、DeltardrA和FrdrA菌株在pH3.0环境下应激1h后的存活率。活化3代后的3种菌株培养至7h时分别取5mL,以8000r/min离心5min,弃净上清液，加入5mLpH3.0的种子培养基吹吸混匀继续培养1h。将酸应激前后的菌液分别等浓度梯度稀释至合适浓度，在固体种子培养基上涂布计数。以酸应激后活菌数与酸应激前的活菌数之比记作菌株存活率，反映菌株酸耐受能力。
1.2.2.4Nisin效价
用改良LB培养基充分活化藤黄微球菌，稀释至合适浓度后加入化开的固体效价培养基，待凝固后打孔作为效价检测培养基。称取1000IU/mg的NisinZ标准品分别配制50、100、200、400IU/mL的Nisin标准液加入效价检测培养基孔内，以抑菌圈直径为横坐标，以10为底的标准品浓度的对数值为纵坐标绘制标准曲线。将活化3代后的F44和DeltardrA菌株按体积分数5%的接种量接种于100mL液体发酵培养基中，在培养至6、8、10、12h时各取500μL菌液加入500μL0.02mol/LHCl溶液，混匀后金属浴100℃煮沸5min,12000r/min离心3min,取上清加入培养基孔内，测量抑菌圈直径，代入标准曲线计算Nisin效价。
1.2.3转录组学测序
将活化3代的F44和DeltardrA菌株培养5h至对数中期,4℃下以8000r/min离心3min,收集菌体制备转录组学测序样品。提取细菌总RNA,随机打断后经两次合成获得cDNA第2链，经修复、连接、扩增、纯化后获得文库。文库质控合格后进行转录组学测序，对原始数据过滤后，用每百万片段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目(Fragmentsperkilobasespermillionfragments,FPKM)表示基因原始表达量。采用DEseq软件对基因表达进行差异分析，以log2foldchange表示试验组与对照组基因表达量差异倍数，以P<0.05且log2foldchange(DeltardrA/F44)
1为筛选条件，获得显著差异表达基因并进行后续分析。
1.2.4实时荧光定量PCR验证
对培养至与转录组学送测样品相同条件的F44和DeltardrA菌株用细菌总RNA提取试剂盒DP430提取总RNA。使用2xSYBRGreenqPCRMix试剂盒反转录生成cDNA。然后在LightCycler480II实时荧光定量PCR仪上进行qPCR试验,以16SrRNA基因作内参,进行3次生物学重复,用2-DeltaDeltaCt方法计算相对表达量。设计引物如表3所示。
表3实时荧光定量PCR引物序列
1.2.5数据处理
使用Excel2021汇总分析试验数据;使用OriginPro2021绘制图表。使用t检验计算差异显著性,其中P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
2结果与分析
2.1突变菌株构建
利用电转化方法将测序无误的重组质粒转入乳酸乳球菌,使用pLEB124-YZ-F/R引物进行菌落PCR并进行琼脂糖凝胶电泳验证，成功得到F44-rdrA过表达菌株,记作FrdrA。阳性结果条带为977bp,对应图1A中泳道1~泳道8。
利用同源重组方法构建乳酸乳球菌F44-rdrA敲除菌株，经过单交换和双交换两轮筛选后，使用rdrA-NB-F/rdrA-NB-R、rdrA-XJ-F/rdrA-XJ-R引物进行菌落PCR并进行琼脂糖凝胶电泳，成功得到F44-rdrA敲除菌株，记作DeltardrA，阳性结果对应图1B中的泳道5、泳道6、泳道7、泳道24，其中图1B为rdrA-NB-F/rdrA-NB-R引物PCR结果，阳性结果为无条带;图1C为rdrA-XJ-F/rdrA-XJ-R引物PCR结果，阳性结果条带为403bp。
2.2表型结果分析
通过测定生长曲线和pH曲线发现，F44、DeltardrA和FrdrA菌株生长情况无显著区别，菌株生长迟缓期、对数期、平台期的时间、菌体量和菌液pH值基本保持一致(图2A、图2B)。
对F44和DeltardrA进行Nisin耐受性试验,结果如图2C所示,DeltardrA菌株的最大有效稀释量为1:10^6,F44对照菌株的最大有效稀释量仅为1:10^4，敲除rdrA基因使F44菌株Nisin耐受能力增强。
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