摘要
群体感应（QS）是一种细胞间信号传递和基因调控机制，与细菌致病性和食品腐败有关。因此，阻断细菌QS系统可能阻止导致食品腐败的QS控制表型。在本研究中，我们旨在研究玫瑰茶多酚（RTP）提取物的抗生物膜和群体感应抑制潜力，该提取物富含多酚（87.52%）和黄酮（61.03%）。RTP特异性抑制了紫色色杆菌026的QS控制紫色杆菌素产生，抑制率达87.56%，且对其生长无显著影响。此外，RTP分别以浓度依赖方式抑制了大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1的群游运动（84.90%和78.03%）和生物膜形成（67.02%和72.90%）。这些发现强烈表明，RTP有潜力被开发为一种新型QS抑制剂和/或抗生物膜剂，以延长食品货架期并提高食品安全。
缩略语：QS，群体感应；RTP，玫瑰茶多酚；AHL，N-酰基高丝氨酸内酯；HSL，高丝氨酸内酯；MIC，最低抑菌浓度；CLSM，共聚焦激光扫描显微镜。
1.引言
群体感应（QS）是一种细胞间信号系统，允许细菌通过释放和接收称为自诱导物的小信号分子来监测其种群密度并控制多种生理过程。在革兰氏阴性菌中，最常见的自诱导物是N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs），而革兰氏阳性菌通常利用肽类作为自诱导物。多种食品腐败菌和致病菌利用QS系统来调控其表型，包括色素产生、群游运动、生物膜形成、毒力因子分泌和降解酶产生。
群体感应的概念促使我们开发一种利用QS抑制剂的新型食品保鲜策略。理想的QS抑制剂被定义为化学稳定、高效的小分子质量化合物，对QS控制表型具有高度特异性且无毒性副作用。近年来，从天然植物资源中获取无毒的抗QS活性物质引起了研究人员的极大关注。一些研究已在多种药用和食用植物中鉴定出QS抑制剂，包括大蒜、香草、苜蓿、鸦葱、豌豆幼苗、石榴提取物以及食用菌如黑木耳。
在先前的研究中，我们首次发现玫瑰花茶提取物在12种中国花茶和19种香料中表现出最强的抗QS活性，表明玫瑰花茶是一种潜在的QS抑制剂。然而，尚未有进一步研究确定玫瑰花茶中哪些化合物负责抗QS活性。据报道，玫瑰花茶含有丰富的多酚化合物，如没食子酸、表儿茶素、花青素、山奈酚和槲皮素，这些物质与抗氧化和抗衰老活性有关。最近，多酚被报道在亚抑制浓度下可抑制QS控制表型。因此，在本研究中，我们旨在研究玫瑰花茶多酚（RTP）提取物对紫色色杆菌026、大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌POA1的抗群体感应和抗生物膜潜力。
2.材料与方法
2.1细菌菌株和培养条件
紫色色杆菌026（野生型菌株紫色色杆菌ATCC31532的双mini-Tn5突变体，具有卡那霉素抗性，不能合成自身的C6-HSL，但保留了对C4-AHL或C6-AHL的响应能力并产生紫色杆菌素）由RobertJ.C.教授（美国德克萨斯州立大学）惠赠，用作生物监测菌株。该菌株常规在有氧条件下于LB培养基（1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.5%氯化钠）中培养，在摇床中以120rpm、28°C振荡培养。紫色色杆菌026的培养基补充有20mg/ml卡那霉素。
受试菌株铜绿假单胞菌PAO1购自中国上海水产研究所。大肠杆菌K-12由中国江苏省南京市疾病预防控制中心提供。铜绿假单胞菌PAO1和大肠杆菌K-12用于测定生物膜形成，在LB培养基中于37°C培养。
2.2RTP提取物制备及活性成分测定
RTP由玫瑰花茶制备。将10g干燥的玫瑰花蕾购自当地超市，用200ml去离子水在室温下超声提取30min。样品过滤后离心10min，12000rpm。所得上清液加入装有活化大孔树脂HPD600的玻璃色谱柱（17×300mm），以60%乙醇洗脱，流速为1min/ml。洗脱组分通过旋转蒸发仪去除溶剂，用适量去离子水复溶，然后冷冻干燥（在108±5Pa腔室压力和-83±1°C冷阱温度下，预先在-20°C冷冻24h），储存于-20°C备用。
RTP活性成分测定如下。总多酚浓度根据Folin-Ciocalteau法进行测定，略有修改。将100μlRTP（1mg/ml）用900μl蒸馏水在试管中稀释，然后加入Folin-Ciocalteu试剂（1M，0.5ml）并充分混合。间隔3min后，加入3ml7.5%Na₂CO₃溶液，混合物间歇混合静置2h。在750nm处用U-3210分光光度计测定混合物的吸光度。用没食子酸（水溶液）制备标准曲线。总黄酮含量采用先前的方法测定，略有修改。取0.5mlRTP（1mg/ml）用1.25ml蒸馏水稀释。然后加入100μl5%NaNO₂溶液。6min后，加入150μl10%AlCl₃·6H₂O溶液，混合物再静置5min。随后加入0.5ml1MNaOH和2.5ml蒸馏水。溶液混合后立即在510nm处测定吸光度。用芦丁（甲醇溶液）制备标准曲线。所有测定均进行三次重复。总多酚含量以没食子酸当量表示，总黄酮含量以芦丁当量表示。
2.3RTP的HPLC分析
RTP分析采用HPLC系统（安捷伦科技，美国特拉华州威明顿），配备G1311四元泵、自动进样器、G1314A可变波长检测器和Star工作站软件（版本Rev.A.10.02）。使用ZORBAXSB-C18反相色谱柱，4.6×250mm，5μm粒径（EclipsePlus，安捷伦科技）。分析柱前连接ZORBAXSB-C18保护柱（4.6×12.5mm，5μm粒径），用于防止样品不溶残留物污染分析柱。
流动相由去离子水（含0.1%甲酸）作为A相和100%乙腈（含0.1%甲酸）作为B相组成。时间程序：起始5%B保持5min，然后在5min内升至10%并保持5min，再在15min内升至13%。B相依次在2min内升至18%，然后在20min内升至35%，再在3min内升至80%。最后在2min内升至100%B并保持3min，然后在5min内回到5%B。流速为0.8ml/min。自动进样器将20μl测试溶液注入HPLC系统。检测波长为280nm。柱温箱温度设为25°C。
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