RovA不能结合rovA调控的T3SS基因的启动子
为确定T3SS基因的这种上调是通过直接还是间接机制实现的，进行了电泳迁移率变动分析（EMSA）。微阵列分析显示lcrGVH-yopBD和yscABCDEFGHIJKLM操纵子的转录在ΔrovA突变株中上调，因此测试了RovA结合lcrG和yscA启动子区域的能力。转录激活因子LcrF是响应环境温度从26°C升至37°C而诱导T3SS转录所必需的。为观察RovA是否可以通过直接调控lcrF来控制T3SS的转录，还测定了RovA对lcrF启动子的结合活性。psaEFABC已被证明受RovA直接调控，psaE的启动子序列能够与RovA蛋白结合。因此，将psaE基因纳入实验作为阳性对照。结果显示，虽然可以稳定检测到RovA对psaE启动子序列的阻滞（图6），但我们未能观察到RovA对lcrF、lcrG和yscA启动子序列的结合活性（图6）。这些结果表明RovA可以通过间接机制调控T3SS的表达。
（图6. RovA结合T3SS的lcrF和lcrG启动子的能力。通过PCR扩增lcrG、yscA、lcrF和psaE的上游区域，并用作EMSA中的靶DNA探针。[c-32P]标记的靶DNA探针与或不与递增量的纯化His-RovA蛋白孵育（泳道1-4）。每个EMSA实验包含三个对照：1）非特异性探针竞争物（含有被证明不受rovA突变影响的基因启动子的未标记DNA探针）；2）特异性探针竞争物（含有被研究基因启动子区域的未标记DNA探针）；和3）无关蛋白（兔抗F1蛋白多克隆抗体）。）
通过透射电子显微镜表征ΔrovA突变株的细胞膜
RovA对细胞包膜蛋白和参与细胞转运/结合过程蛋白的广泛调控影响提示，ΔrovA突变株的细胞膜结构和功能可能受损。这促使我们使用透射电子显微镜（TEM）观察细菌细胞膜。当在26°C TMH中生长时，TEM结果显示野生型菌株的细菌膜光滑，边界锐利清晰（图7A）。然而，对于许多ΔrovA突变株细胞，发现许多具有高电子密度的小颗粒状结构围绕在膜周围（图7B、C、D），并且在破裂细胞附近经常发现可能由小颗粒状结构形成的聚集大团块（图7D）。有相当比例的ΔrovA突变株细胞似乎已裂解，提示在这些实验条件下，ΔrovA突变株中的细菌膜可能构建不同，因此不稳定，导致细菌细胞破裂。通过计数十个随机选择的视野中被电子致密颗粒包围的野生型细菌细胞以及裂解或明显健康的细胞，我们发现未观察到裂解的细菌细胞，约2%的细胞显示与电子致密颗粒相关。然而，ΔrovA突变株的这些数字分别为11%和28%。哺乳动物宿主体温为37°C，这将通过热调控因子LcrF的作用大大增加T3SS的转录，37°C环境中缺乏毫摩尔浓度的钙将触发Yop蛋白的分泌并完全激活T3SS的转录。
因此，我们进行TEM分析以确定在T3SS转录和分泌诱导条件下RovA对细菌膜的影响。当ΔrovA突变株细胞在37°C含和不含钙的TMH中生长时，观察到与26°C生长的细菌相似的结果，即许多ΔrovA突变株细胞被电子致密颗粒包围，一些细胞受到不同程度的损伤（图7F-H、J-L）。在一些rovA突变株细胞表面可观察到气泡（图7G和F），一些细胞完全裂解，周围有剩余的电子致密物质（图7J）。总之，这些结果表明，无论细菌在T3SS诱导或非诱导条件下生长，鼠疫耶尔森菌的细胞膜构建和细胞完整性均显著依赖于RovA，这表明RovA在细胞膜构建中可能发挥关键的调控作用，并且是维持细胞膜稳定性所必需的。
（图7. RovA突变导致细菌膜改变。细菌菌株在含2.5mM钙的TMH培养基中26°C培养至静止期早期（A，野生型菌株；B、C和D，ΔrovA突变株），或在相同培养基中培养至OD600 0.3然后转移至37°C 3小时（E，野生型菌株；F、G和H，ΔrovA突变株）；或在26°C无钙TMH中培养至OD600 0.3然后转移至37°C 3小时（I，野生型菌株；J、K和L，ΔrovA突变株）。收获细菌细胞并进行透射电子显微镜观察。ΔrovA突变株的细菌细胞在B、C、F、G、H、K和L中显示被电子致密颗粒包围。J和K中的箭头指示破裂细胞，破裂细胞周围电子致密物质的覆盖可清楚观察到。F和G中的箭头指示细菌膜上的气泡。比例尺：C、H和L中为200nm；F、G和K中为500nm；A、B、D、E、I和J中为1000nm。）
ΔrovA突变株的膜通透性显著降低
TEM显示rovA突变破坏了ΔrovA突变株的细胞膜结构。为检验RovA对细胞膜功能的调控作用，我们接下来测定了ΔrovA突变株的膜通透性。CFSE（羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯）是一种小分子染料，可以被动扩散进入活细胞。它是无色且无荧光的，但一旦进入细胞，通过细胞内酯酶对乙酸基团的作用可产生强烈的荧光，然后通过流式细胞术分析。将野生型和ΔrovA突变株细胞在37°C PBS中与1mM CFSE孵育标记后，彻底洗涤，重悬于PBS缓冲液中并进行流式细胞术分析。结果表明，与野生型菌株相比，ΔrovA突变株对CFSE的被动通透率显著降低，提示ΔrovA突变株的膜通透性降低（图8）。当用pAraRovA互补的ΔrovA突变株进行CFSE染色和流式细胞术分析时，染色细胞的百分比恢复，甚至高于野生型菌株。这可能是由于阿拉伯糖诱导型启动子araBADp控制下RovA的过表达，其表达水平高于菌株201。在本研究中，ompC在ΔrovA突变株中被观察到大幅下调，如前几节所述。OmpC是影响外膜通透性的主要外膜孔蛋白之一，在小肠结肠炎耶尔森菌的ompC突变株中已观察到膜通透性降低。OmpC表达的下调，以及RovA对许多细胞包膜和转运/结合蛋白的积极调控，可能是ΔrovA突变株膜通透性改变的原因。这些数据表明，不仅细胞膜构建而且其功能都被RovA突变破坏。
（图8. ΔrovA突变株对CFSE的细胞膜通透性降低。菌株201、ΔrovA突变株和ΔrovA-pAraRovA与1mM CFSE孵育10分钟并进行流式细胞术分析。荧光细菌的百分比显示为三次重复实验的平均值±标准差（A）。通过直方图显示野生型（实线）、ΔrovA突变株（虚线）和ΔrovA-pAraRovA（点线）的CFSE染色细菌。数据代表3次独立实验。使用Student t检验计算野生型和ΔrovA突变株之间的差异，p<0.05（p=0.02，标记为*）被认为具有统计学意义。）
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