T3SS在ΔrovA突变株中转录和表达水平均上调
为验证RovA对T3SS基因转录活性的调控作用，我们构建了一系列含有lacZ融合启动子的pRW50衍生质粒（表2）。耶尔森菌T3SS的基因组织由四个大转录单元组成，包括yopN-tyeA-sycN-yscX-YLcrDR、yscABCDEFGHIJKLM、yscNOPQRSTU和lcrGVH-yopBD操纵子，以及质粒pCD1中的分散基因，包括virG/yscW、yops及其伴侣蛋白syc基因。因此，我们选择构建了pyopN-、pyscA-、pyscN-和plcrG-lacZ融合体，以代表不同背景菌株中这些操纵子的转录活性。含有yop启动子（pyopT、pyopJ、pyopQ）的质粒在lacZ基因上游直接表达，在ΔrovA突变株中表达的β-半乳糖苷酶水平远高于野生型菌株（图4B）。在编码T3SS机器不同部分的四个大操纵子中，lcrGVH-yopBD和yscABCDEFGHIJKLM在转录谱分析中发现在ΔrovA突变株中上调（>2倍），而对于另外两个操纵子yopN-tyeA-sycN-yscX-YLcrDR和yscNOPQRSTU，未检测到显著差异。与微阵列结果高度一致，plcrG和pyscA表达的β-半乳糖苷酶活性在ΔrovA突变株中显著高于野生型菌株，但pyopN仅观察到有限差异（远低于2倍），pyscN无差异（图4A）。psaA基因已被证明受RovA正调控，而ompC此前已被证明与膜通透性相关，在微阵列分析中在ΔrovA突变株中下调超过20倍。因此，这两个基因也被纳入β-半乳糖苷酶测定，结果验证了微阵列分析结果，显示psaA和ompC在ΔrovA突变株中显著下调。总之，β-半乳糖苷酶活性测定表明，rovA基因突变显著提高了T3SS组分的表达，证实了微阵列结果。
为确定Yop表达是否也在ΔrovA突变株中增加，对在37°C无钙TMH中生长的细菌培养物的上清液和细胞沉淀中的Yop蛋白进行了SDS-PAGE分离和Western blotting分析。对不同Yop变体的Yop分泌和表达测定至少进行了三次，可以一致观察到YopE和YopJ在ΔrovA突变株中的表达高于野生型菌株（图5，比较泳道3和4与泳道1和2）。培养上清液中分泌的YopE和YopJ的量也显著增加（图5，比较泳道2和4）。然而，YopM表达未检测到显著差异。在几次独立实验中，YopM条带下方可重复检测到一条强条带（泳道4），我们假设它可能是YopM的降解肽。如果考虑YopM的降解产物，ΔrovA突变株中YopM的表达几乎与野生型菌株相等。通过将反式互补的rovA基因引入ΔrovA突变株，Yop表达和分泌部分恢复（图5，泳道5和泳道6）。这些数据表明III型分泌基因在转录和表达水平上均上调。
（图4. RovA蛋白对受调控基因座启动子活性的影响。含有空载体pRW50或含有相应启动子的pRW50衍生质粒的鼠疫耶尔森菌菌株201和ΔrovA突变株在26°C无钙TMH中培养至OD600 1.0，然后转移至37°C再培养3小时。显示yscN、yscA、lcrG和yopN（A）以及psaA、yopQ、yopJ、yopT和ompC（B）启动子活性的β-半乳糖苷酶活性（Miller单位）。所示数据为三次独立实验的平均值，标准差已标明。使用Student t检验计算野生型菌株和ΔrovA突变株之间β-半乳糖苷酶活性的差异，p<0.05被认为具有统计学意义。p值表示如下：p<0.05，p<0.01，p<0.001。）
（图5. RovA对Yop表达和分泌的影响。细菌菌株在26°C无钙TMH培养基中培养至OD600约1.0，然后转移至37°C 3小时以诱导Yop蛋白的表达和分泌。使用TCA沉淀培养上清液中的蛋白质。细菌细胞沉淀经SDS-PAGE分离，使用针对YopE、YopJ和YopM的兔多克隆抗体检测特定蛋白质（A）。C和S分别代表从细胞沉淀和细菌培养上清液中分离的蛋白质。在泳道4中，YopM条带正下方的条带可能是YopM的降解产物，在ΔrovA突变株中可稳定检测到大量该产物；然而，在野生型和用ΔrovA-pAraRovA互补的ΔrovA突变株中该产物少得多。使用TotalLab软件对Western blot进行密度分析，数字表示每行各泳道与泳道1的密度值比值（B）。W：野生型菌株；M：ΔrovA突变株；C：互补菌株ΔrovA-pAraRovA。）
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