结果
ΔrovA突变株的构建和鉴定
使用自杀载体方法构建了鼠疫耶森菌菌株201的框内rovA缺失突变株，缺失了RovA的41-139位氨基酸。将rovA基因全长及其上游600bp序列克隆到pBAD24中，生成pAraRovA，然后用于互补ΔrovA突变株。为确认ΔrovA突变株和互补菌株的成功构建，将亲本菌株、ΔrovA突变株和ΔrovA-pAraRovA在BHI肉汤中26°C培养至静止期（此前已证明此时rovA表达达到最大）。通过Western blot分析测定各菌株中RovA的表达（图1）。观察到代表RovA的17kD条带可在野生型菌株和ΔrovA-pAraRovA中检测到，但在ΔrovA突变株中未检测到，表明rovA基因已成功破坏。将外源rovA基因在阿拉伯糖诱导型启动子araBADp控制下引入突变株后，添加阿拉伯糖可恢复RovA表达。这些结果表明ΔrovA突变株和互补菌株ΔrovA-pAraRovA已成功构建。
Yop和T3SS机器的最大体外表达在37°C无毫摩尔浓度钙的条件下达到，通常伴随称为低钙反应（LCR）的生长限制。为研究rovA基因突变是否影响LCR，测定了ΔrovA突变株在含和不含2.5mM钙的TMH中的生长曲线，并与菌株201进行比较。ΔrovA突变株和野生型菌株在37°C无钙TMH中生长时均进入生长限制，表明rovA突变不影响T3SS对低钙环境的反应（图2）。观察到ΔrovA突变株在含钙TMH中的生长略慢于野生型菌株，无论是在26°C还是37°C（数据未显示）。
（图1. 鼠疫耶尔森菌菌株201、ΔrovA突变株和ΔrovA-pAraRovA中RovA的表达。将26°C BHI中过夜培养的细菌菌株收获，全细胞裂解物经SDS-PAGE分离。使用针对His标记RovA的兔多克隆抗体通过Western blotting检测rovA的表达。为诱导ΔrovA-pAraRovA中RovA的表达，将阿拉伯糖以所示浓度加入培养基中。）
（图2. ΔrovA突变株中T3SS的低钙反应未改变。将菌株201和ΔrovA突变株的过夜培养物稀释20倍到添加2.5mM钙（+）或不添加（-）的新鲜TMH中，26°C培养至OD600约0.3，然后转移至37°C。在所示时间点监测细菌培养物的OD600值，持续24小时直至培养物达到静止期。实验重复三次，结果相似，显示一个代表性结果。）
微阵列分析揭示T3SS基因在ΔrovA突变株中上调
比较菌株201和ΔrovA突变株在T3SS诱导条件下生长的转录谱，结果显示rovA的破坏影响了141个基因的转录。其中，69个基因上调，72个基因下调（详见补充表S2）。根据鼠疫耶尔森菌CO92基因组注释，这些基因分布在19个功能类别中（补充图S1）。有趣的是，19个III型分泌基因（占所有已知T3SS基因的40%以上）在ΔrovA突变株中差异表达，且全部上调，暗示突变株中T3SS表达增强。值得注意的是，16个细胞包膜蛋白和21个转运/结合蛋白受到rovA突变的显著影响（表1），这些类别受影响的基因数量显著高于其他rovA调控基因类别（补充图S1）。大多数差异调控的细胞包膜蛋白被注释为推定输出膜蛋白或功能未明确的脂蛋白，而wzzE、slyB和yiaF的同源物可在大肠杆菌中找到。氨基酸、碳水化合物、有机酸、醇和离子的转运/结合蛋白也受到积极调控。这些结果暗示突变株中细菌膜的结构和转运功能可能受到显著影响。
| 表1. 细胞包膜、转运/结合蛋白和T3SS编码基因功能类别中受RovA调控的基因 | |||||
| 基因ID | 变化倍数 | 基因名称 | 产物 | 分类编号 | 功能类别 |
| YPO0702 | 2.43 | 假定输出蛋白 | 3.C.1 | 细胞包膜 | |
| YPO1689 | 1.93 | 假定脂蛋白 | 3.C.1 | 细胞包膜 | |
| YPO1718 | 8.22 | ---- | 假定输出蛋白 | 3.C.1 | 细胞包膜 |
| YPO2373 | 7.69 | slyB, pcpY, pcp | 假定脂蛋白 | 3.C.1 | 细胞包膜 |
| YPO2511 | 2.11 | ---- | 假定输出蛋白 | 3.C.1 | 细胞包膜 |
| YPO2782 | 2.93 | ----- | 假定膜蛋白 | 3.C.1 | 细胞包膜 |
| YPO3865 | 2.46 | wzzE, wzz, b3785 | 假定脂多糖生物合成蛋白 | 3.C.2 | 细胞包膜 |
| YPO2477 | 2.37 | ---- | 假定溶质结合蛋白 | 4.A | 转运/结合蛋白 |
| YPO1853 | 3.06 | putP | 脯氨酸通透酶 | 4.A.1 | 转运/结合蛋白 |
| YPO2958 | 3.35 | sfuA, yfuA | 铁(III)结合周质蛋白 | 4.A.2 | 转运/结合蛋白 |
| YPO0858 | 5.24 | ---- | 糖转运ATP结合蛋白 | 4.A.3 | 转运/结合蛋白 |
| YPO0860 | 2.28 | ----- | 糖结合周质蛋白 | 4.A.3 | 转运/结合蛋白 |
| YPO0959 | 1.88 | ---- | 假定糖ABC转运体周质结合蛋白 | 4.A.3 | 转运/结合蛋白 |
| YPO1757 | 2.30 | manY, ptsP, pel | PTS系统，甘露糖特异性IIC组分 | 4.A.3 | 转运/结合蛋白 |
| YPO2501 | 2.51 | rbsB | 糖结合蛋白前体 | 4.A.3 | 转运/结合蛋白 |
| YPCD1.05c | 2.44 | sycE | 假定yopE伴侣蛋白sycE, yerA, yopE靶向蛋白 | ||
| YPCD1.16c | 3.36 | 假设蛋白 | |||
| YPCD1.17c | 2.60 | ylpA | 假定脂蛋白前体假基因, ylpA | ||
| YPCD1.19c | 4.15 | yopK, yopQ | 假定毒力决定蛋白, yopK, yopQ | ||
| YPCD1.20 | 2.69 | yopT | 假定细胞毒性效应蛋白, yopT | ||
| YPCD1.21 | 2.52 | sycT | 假定yopT伴侣蛋白, sycT | ||
| YPCD1.23 | 3.77 | 假设蛋白, Y0062 | |||
| YPCD1.26c | 8.09 | yopM | 可能的靶向效应蛋白, yopM | ||
| YPCD1.28c | 3.16 | yopD | 假定Yop负调控/靶向组分, yopD | ||
| YPCD1.29c | 2.79 | yopB | 假定Yop靶向蛋白, yopB | ||
| YPCD1.30c | 2.96 | lcrH, sycD | 假定yopB/yopD伴侣蛋白, lcrH, sycD | ||
| YPCD1.31c | 4.15 | lcrV | 假定V抗原, 抗宿主蛋白/调节因子, lcrV | ||
| YPCD1.32c | 3.43 | lcrG | 假定Yop调节因子, lcrG | ||
| YPCD1.37c | 2.13 | sycN | 假定III型分泌蛋白, sycN | ||
| YPCD1.49 | 2.02 | lcrF, virF | 假定热调节蛋白, lcrF, virF | ||
| YPCD1.55 | 1.96 | yscF | 假定III型分泌蛋白, yscF | ||
| YPCD1.60 | 1.94 | yscK | 假定III型分泌蛋白, yscK | ||
| YPCD1.61 | 1.97 | yscL | 假定III型分泌蛋白, yscL | ||
| YPCD1.71c | 2.76 | yopP, yopJ | 假定靶向效应蛋白, yopP, yopJ | ||
| YPO1222 | -25.21 | ompC, meoA, par | 外膜蛋白C, 孔蛋白 | 3.C | 细胞包膜 |
| YPO0063 | -2.83 | ---- | 假定膜蛋白 | 3.C.1 | 细胞包膜 |
| YPO0079 | -4.64 | sbp1 | 输出硫酸盐结合蛋白 | 3.C.1 | 细胞包膜 |
| YPO0917 | -2.57 | yggE | 假定输出蛋白 | 3.C.1 | 细胞包膜 |
| YPO2262 | -3.82 | ----- | 假定输出蛋白 | 3.C.1 | 细胞包膜 |
| YPO2315 | -3.34 | ----- | 假定输出蛋白 | 3.C.1 | 细胞包膜 |
| YPO2670 | -4.12 | ureG | 脲酶辅助蛋白 | 3.C.1 | 细胞包膜 |
| YPO4070 | -3.16 | yiaF | 假定输出蛋白 | 3.C.1 | 细胞包膜 |
| YPO2943 | -2.78 | ---- | 外膜引导蛋白(假基因) | 3.C.3 | 细胞包膜 |
| YPO2339 | -2.08 | mppA | 假定周质胞壁肽结合蛋白 | 4.A | 转运/结合蛋白 |
| YPO4110 | -2.71 | ----- | ABC转运体通透酶 | 4.A | 转运/结合蛋白 |
| YPO4111 | -3.77 | ---- | 假定周质溶质结合蛋白 | 4.A | 转运/结合蛋白 |
| YPO1937 | -3.73 | ansP | L-天冬酰胺通透酶 | 4.A.1 | 转运/结合蛋白 |
| YPO4109 | -4.28 | ---- | 假定氨基酸转运系统通透酶 | 4.A.1 | 转运/结合蛋白 |
| YPO2338 | -3.86 | ---- | CorA样Mg2+转运蛋白 | 4.A.2 | 转运/结合蛋白 |
| YPO0182 | -4.69 | tauA, ssiA | 假定牛磺酸结合周质蛋白前体 | 4.A.3 | 转运/结合蛋白 |
| YPO0183 | -2.32 | tauB, ssiB | 假定牛磺酸转运ATP结合蛋白 | 4.A.3 | 转运/结合蛋白 |
| YPO0184 | -6.41 | tauC, ssiC | 假定牛磺酸转运系统通透酶蛋白 | 4.A.3 | 转运/结合蛋白 |
| YPO3012 | -2.83 | cysA | 硫酸盐转运ATP结合蛋白 | 4.A.5 | 转运/结合蛋白 |
| YPO3014 | -2.94 | cysT | 硫酸盐转运系统通透酶蛋白CysT | 4.A.5 | 转运/结合蛋白 |
| YPO3015 | -2.84 | cysP | 硫代硫酸盐结合蛋白 | 4.A.5 | 转运/结合蛋白 |
| YPO3624 | -5.91 | ssuA | 假定脂肪族磺酸盐结合蛋白 | 4.A.6 | 转运/结合蛋白 |
ΔrovA突变株在小鼠模型中皮下和静脉感染后毒力略有减弱
为评估RovA对菌株201毒力的贡献，使用野生型菌株和ΔrovA突变株在BALB/c小鼠中进行了半数致死剂量（LD50）分析。Cathelyn等人的先前研究表明，RovA是CO92菌株完全毒力所必需的，ΔrovA突变株在皮下接种后LD50分析中减弱了80倍，但在鼻内或腹腔感染的小鼠中仅略有减弱。与Cathelyn等人的结果相反，我们发现ΔrovA突变株在静脉感染小鼠中的毒力减弱比皮下感染小鼠更显著，尽管两种感染途径的减弱都是轻微的。当小鼠通过皮下注射感染时，菌株201和ΔrovA突变株的LD50值分别为3和9.2 CFU（图3），而静脉感染小鼠中野生型和ΔrovA突变株的LD50分别为1.9和10.5 CFU。静脉和皮下感染小鼠的死亡平均天数均延迟，静脉感染延迟更显著（图3）。我们的结果与Cathelyn等人的结果之间的这种差异可能源于所使用的不同实验条件，从所用动物到细菌生长条件。更重要的是，两项研究中使用的野生型鼠疫耶尔森菌菌株不同，即本研究使用了生物型Microtus菌株201，而Cathelyn等人使用了生物型Orientalis菌株CO92。
（图3. 鼠疫耶尔森菌菌株201和ΔrovA突变株在小鼠模型中的毒力分析。BALB/c小鼠通过皮下或静脉感染途径，以所示浓度的ΔrovA突变株（A）或菌株201（B）细菌悬液攻击，绘制感染后天数的存活率。）
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