WS 4560^T^和WS 4615在以下选择性培养基上划线:PALCAM琼脂(SIFIN)、Ottaviani和Agosti李斯特菌琼脂LAOA(Bio-Rad)、XLD琼脂(SIFIN)、Brilliance沙门氏菌琼脂(Oxoid)和溴化十六烷基三甲铵琼脂(Merck)。菌株在30°C的选择性培养基上培养48小时。在PALCAM琼脂上,形成灰色菌落,质地粗糙,边缘不连续,中心深色凹陷。在LAOA琼脂上检测到生长良好的浅蓝绿色菌落,直径1.0-2.5 mm。在XLD、Brilliance沙门氏菌或溴化十六烷基三甲铵琼脂上未观察到生长。
按照先前描述的方法检查甲基红试验、Voges-Proskauer试验和硝酸盐还原为亚硝酸盐,两株分离株的结果分别为阳性、阴性和阳性。根据制造商建议,使用BBL Enterotube II(Becton Dickinson)测试两株分离株的吲哚和H~2~S产生以及脲酶水解和外源性柠檬酸盐利用情况。BBL Enterotube II试验在30°C培养48小时后读取结果。未利用脲和外源性柠檬酸盐,未产生吲哚和H~2~S。使用bioMérieux的API Listeria试纸条进行生化试验。试纸条在30°C培养24小时后读取。API Listeria试纸条显示芳基酰胺酶、α-甘露糖苷酶、D-核糖、葡萄糖-1-磷酸和D-塔格糖的检测结果为阴性。观察到七叶苷水解、D-阿拉伯糖醇酸化、D-木糖、L-鼠李糖和甲基α-D-吡喃葡萄糖苷酸化为阳性。WS 4560^T^和WS 4615的API Listeria图谱为2710,与制造商数据库中任何已知的李斯特菌图谱均不匹配。此外,使用API 50CH系统(bioMérieux)按照制造商建议测定碳水化合物的产酸情况。API 50CH试验在30°C厌氧条件下培养,在1、2、5、7和14天后读取结果。WS 4560^T^和WS 4615的生化检查结果相同,培养14天后获得的结果列于种的描述中。
使用3%(v/v)过氧化氢检查过氧化氢酶活性。按照制造商说明使用Bactident氧化酶试纸条(Oxoid)进行氧化酶测试。两株分离株均为过氧化氢酶阳性,氧化酶阴性。
在含5%(v/v)去纤维蛋白羊血(Oxoid)红细胞悬液的BHI肉汤(Merck)中,通过30°C有氧培养检查WS 4560^T^和WS 4615的溶血活性。在含5%去纤维蛋白羊血的哥伦比亚琼脂(Oxoid)上进行CAMP试验。用于CAMP试验的菌株为金黄色葡萄球菌DSM 12463和马红球菌DSM 20307^T^。在含红细胞的BHI肉汤和血琼脂平板上均未观察到溶血。CAMP试验结果也为阴性。
基因组DNA的G+C含量由德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ,不伦瑞克,德国)通过HPLC分析。WS 4560^T^和WS 4615的DNA G+C含量分别为41.8 mol%和41.0 mol%。
醌的检测由B. Tindall博士(DSMZ)按照先前描述的方法进行。WS 4560^T^和WS 4615的唯一呼吸醌为甲萘醌MK-7(100%)。肽聚糖结构的分析以及DNA-DNA杂交研究由DSMZ按照描述的方法进行,包括描述的修改。肽聚糖含有内消旋二氨基庚二酸作为诊断性二氨基氨基酸,已知属于A1c型。WS 4560^T^与洛氏李斯特菌DSM 22097^T^之间的DNA-DNA杂交分析由DSMZ重复进行,相似性值分别为21.0%和24.3%。WS 4560^T^标记DNA与WS 4615之间的杂交分别为94.2%和96.0%。
对于细胞脂肪酸分析,细胞在LB肉汤(10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5 g NaCl、2 g D-葡萄糖,pH 7.0)中30°C振荡培养48小时。WS 4560^T^、WS 4615、洛氏李斯特菌DSM 22097^T^、单核细胞增生李斯特菌DSM 20600^T^和格氏李斯特菌DSM 20601^T^的细胞脂肪酸分析由DSMZ进行。细胞脂肪酸图谱使用Agilent 6890N气相色谱仪(软件Sherlock版本6.1;MIDI)按照TSBA 40方法测定。WS 4560^T^和WS 4615的主要脂肪酸为anteiso-C~15:0~(分别约66%和47%)和anteiso-C~17:0~(分别约24%和33%)。检测到的其他脂肪酸列于表S1。
通过完整16S rRNA基因序列和prs、recA、sigB和HSP60部分基因序列的串联分析确定分离株的系统发育位置。DNA按照先前描述的方法提取,在细胞裂解后增加一个加热步骤(95°C 5分钟)。使用通用引物通过PCR扩增完整的16S rRNA基因。PCR产物的循环测序由Sequiserve(德国Vaterstetten)进行。
