摘要
氨基甲酸乙酯（EC）是一种多效性致癌物，在葡萄酒中主要由乙醇与尿素自发化学反应形成。精氨酸是葡萄汁中的主要氨基酸之一，被精氨酸酶（由CAR1编码）代谢为鸟氨酸和尿素。为了减少尿素和EC的产量，通过连续删除二倍体葡萄酒酵母WY1中的两个CAR1等位基因，构建精氨酸酶缺陷重组菌株YZ22（Δcar1/Δcar1），以阻断尿素产生途径。RT-qPCR结果表明，YZ22几乎不表达CAR1基因，且YZ22菌株的精氨酸酶比活性比亲本菌株WY1低12.64倍。发酵结果表明，葡萄酒中尿素和EC含量分别降低了77.89%和73.78%。此外，在葡萄酒储存期间，由于尿素含量较低，EC的形成速度也大大降低。而且，两个CAR1等位基因缺失菌株YZ22在生长和发酵特性方面与亲本菌株基本相当。我们的研究还表明，葡萄酒中的EC主要来源于酵母产生的尿素。
引言
氨基甲酸乙酯（EC）是一种多效性致癌物，可导致肺癌、淋巴细胞白血病、肝癌和皮肤黑色素瘤的发病率增加，这一结论首次于1943年被证实。2007年，国际癌症研究机构将EC重新分类为2A组，意味着它可能对人类致癌。EC是发酵食品（包括葡萄酒）和酒精饮料中发酵、蒸馏和储存过程的副产品。葡萄酒是一种健康酒精饮料，在全世界广受欢迎。在加拿大，餐酒中EC含量的法定限值为30μg/L。此外，美国食品药品监督管理局为餐酒（酒精含量≤14%）设定了15μg/L的自愿性目标，自1998年收获季开始执行。
EC在葡萄酒发酵和储存过程中由乙醇与氨基甲酰化合物（包括酵母细胞释放的尿素、乳酸菌释放的瓜氨酸和氨基甲酰磷酸）自发化学反应形成。其中，酵母细胞在酒精发酵过程中释放的尿素是葡萄酒中EC的主要前体。在葡萄酒发酵过程中，精氨酸（葡萄酒中尿素的最重要来源）被精氨酸酶（由CAR1基因编码）裂解为鸟氨酸和尿素。酿酒酵母能够通过脲基酰胺裂解酶（由DUR1,2基因编码）的作用代谢尿素。然而，尿素降解并不总是紧随精氨酸代谢之后发生。因此，尿素通过由DUR4编码的尿素转运蛋白Dur4p逐渐排出酵母细胞，之后可通过由DUR3编码的尿素转运蛋白Dur3p重新吸收，作为氮源利用。尿素的排泄和再吸收都会影响发酵结束时葡萄酒中尿素的含量。
根据以往研究，葡萄酒中的EC可通过物理、化学、酶学和代谢工程途径降低。然而，代谢工程技术为抑制酵母中尿素的产生或增强尿素的代谢能力提供了新方法，从而也降低了EC的含量。在过去几十年中，人们对EC形成机制和防止酒精饮料中EC积累的策略进行了大量研究。Coulon等人通过过表达DUR1,2基因开发了尿素降解工业葡萄酒酵母522^DUR1,2，由功能增强菌株（522^DUR1,2）生产的霞多丽葡萄酒中EC含量减少了89%。随后，Dahabieh等人通过过表达DUR3基因创建了尿素降解工业葡萄酒酵母522^DUR3，功能增强菌株（522^DUR3）使霞多丽葡萄酒中EC降低了81%。CAR1缺失突变酵母已被构建用于降低三种酒精饮料（清酒、樱桃烈酒和中国黄酒）中的EC浓度。所有这些CAR1缺失突变酵母都能显著降低相应发酵酒精饮料中的EC，且与其相应亲本菌株的发酵行为没有显著差异。
本研究旨在通过阻断酵母细胞在酒精发酵过程中形成尿素的途径来降低葡萄酒中EC的产量。利用两个CAR1缺失盒从具有两个CAR1等位基因的二倍体亲本菌株构建了单CAR1等位基因缺失或双CAR1等位基因缺失的二倍体菌株，并通过引入质粒pSH-Zeocin去除KanMX标记基因。验证了重组菌株在发酵和储存过程中降低葡萄酒中EC的能力。此外，还比较了重组菌株与亲本菌株的CAR1基因表达mRNA水平、精氨酸酶活性、生长曲线和发酵特性。
材料与方法
菌株、质粒和培养条件
本研究中使用的所有菌株和质粒及其相关基因型列于表1。本研究中使用的二倍体葡萄酒酵母菌株WY1和大肠杆菌菌株DH5α来自天津科技大学天津工业微生物重点实验室的微生物菌种保藏中心。
表1 本研究使用的菌株和质粒| 菌株或质粒 | 相关特征 | 参考或来源 |
|---|---|---|
| 菌株 | ||
| E.coli DH5α | supE44△lacU169(φ 80lacZ△M15) hsdR17 recAl endAl gyrA96 thi-1 relA | Stratagene |
| WY1(亲本菌株) | 二倍体葡萄酒酵母菌株 | 本研究 |
| YZ10 | WY1△carl/CAR1::loxP-KanMX-loxP | 本研究 |
| YZ11 | WY1△carl/CAR1::loxP | 本研究 |
| YZ21 | WY1△carl/△car1::loxP::loxP-KanMX-loxP | 本研究 |
| YZ22 | WY1△carl/△car1::loxP::loxP | 本研究 |
| 质粒 | ||
| pUC19 | Ap', 克隆载体 | Invitrogen |
| pUG6 | 大肠杆菌/酿酒酵母穿梭载体，含有Amp+和loxP-kanMX-loxP破坏盒 | [10] |
| pSH-Zeocin | Zeor, Cre表达载体 | [14] |
| pUC-CA1B1K | Ap', Kan', 含有CA1-loxP-KanMX-loxP-CB1 | 本研究 |
| pUC-CA2B2K | Ap', Kan', 含有CA2-loxP-KanMX-loxP-CB2 | 本研究 |
大肠杆菌在37°C的Luria-Bertani培养基（由1% NaCl、1%胰蛋白胨和0.5%酵母提取物组成）中培养，并添加氨苄青霉素（100mg/L）以筛选阳性大肠杆菌转化子。YEPD培养基（由1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖组成）用于30°C培养酵母菌株，向培养基中添加终浓度为300mg/L的G418以筛选携带KanMX基因的酵母转化子。为筛选耐Zeocin的酵母菌株，向酵母培养YEPD平板中添加500mg/L Zeocin（美国威斯康星州麦迪逊市Promega公司）。然后，使用YEPG培养基（由1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%半乳糖组成）诱导酵母转化子中Cre的表达。本研究中使用的所有固体培养基均含有2%琼脂（美国Difco公司）。
相关新闻推荐
1、产香酵母筛选、生长曲线、耐受性及与酿酒酵母混菌发酵果酒的感官评价——结果、讨论
3、牛皮肤结节病毒分离鉴定、生长曲线、免疫荧光、TCID50测定（一）