3. 结果与讨论
3.1. 粗甘油批次的分析
粗甘油批次的化学成分因来源、用于生产生物柴油的催化剂类型、酯交换效率、原料中的其他杂质以及甲醇和催化剂是否回收而异。因此，对来自不同工业的所有粗甘油批次的成分进行了表征。废甘油批次来自代表3个不同生产行业的5家不同公司。称为G2、G3和G4的甘油来自生物柴油生产。甘油G1是肥皂生产过程的废产品；G5来自硬脂酸生产。所有公司都位于波兰南部。高压灭菌后粗甘油批次的成分列于表1和表2中。甘油和氮的含量因批次而异，范围分别为42%~87%和0.023%~0.136%。高压灭菌后未检测到甲醇。粗甘油（G1~G5）中的脂质含量范围为0%~0.4%。
3.2. 粗甘油对解脂耶氏酵母A101生长的影响
如今，微生物油脂由许多底物生产，但要成为合适的生物柴油，生产成本必须是可行的。因此，近年来我们的研究目标是除葡萄糖外的新碳源的应用。在此，评估了五种未经任何预处理的工业废产品（表1和表2）。
解脂耶氏酵母可以轻松利用粗甘油作为碳源。然而，此前有报道称粗甘油中的各种杂质可能对微生物生长产生负面影响。为了评估粗甘油对解脂耶氏酵母A101生长的影响，测试了一系列含有各种类型粗甘油的YNB培养基，并使用纯甘油作为对照。如图1所示，我们观察到不同批次粗甘油之间的生长速率存在显著差异。来自生物柴油生产的粗甘油批次（G2~G4）显示出与纯甘油（G6）相似的短滞后期。此外，其中两个的生长比对照更旺盛。然而，在G3甘油上生长的菌株的生长速率低于使用纯甘油和其他粗甘油批次所达到的水平。推测高含量的杂质可能对酵母生长产生负面影响。
有趣的是，来自肥皂和硬脂酸生产的粗甘油具有非常长的滞后期（24~30小时）。然而，当使用来自皂化的粗甘油（G1）时，细胞生长显著高于其他碳源，包括纯甘油。在皂化过程中，植物或动物脂肪被水解，推测脂肪酸酯的残留物被解脂耶氏酵母利用，从而产生更高的生物量。在硬脂酸生产衍生的粗甘油上生长的细胞的生长速率达到了与对照相似的水平。图1表明，来自不同工业的所有类型粗甘油都被解脂耶氏酵母有效利用，可用作底物。本研究的下一步是验证解脂耶氏酵母A101高效生产SCO的最佳C/N比。
图1. 解脂耶氏酵母A101在补充有粗甘油和纯甘油的YNB培养基上的生长。黑色虚线G1（μmax=0.07 h⁻¹）；浅灰色线G2（μmax=0.08 h⁻¹）；黑色点线G3（μmax=0.11 h⁻¹）；深灰色线G4（μmax=0.10 h⁻¹）；黑色线G5（μmax=0.08 h⁻¹）；深灰色虚线G6（μmax=0.10 h⁻¹）。最大比生长速率（μmax h⁻¹）通过拟合方程（lnOD₂–lnOD₁）/t₂–t₁在每个甘油批次的指数生长期内估算。
3.3. 碳氮比对解脂耶氏酵母A101生长和脂质积累的评价
解脂耶氏酵母在环境中碳过量与氮饥饿相关时积累脂质。在此过程中，碳代谢转向脂质积累，直到达到阈值，之后过量碳以柠檬酸形式排出。用于脂肪酸和脂质生产的培养基和C/N比的优化取决于菌株和生长条件。因此，我们首先通过在纯甘油的摇瓶实验中改变碳/氮比来解决这个问题。
如图2所示，生物量在C/N 75和C/N 100时达到最高产量。有趣的是，对于生物量和脂质生产，我们注意到在C/N 75、C/N 100和C/N 150范围内的曲线没有显著差异。生物量分别达到8.46±0.23 g·L⁻¹、7.97±0.23 g·L⁻¹和7.41±0.19 g·L⁻¹，脂质含量分别为2.3±0.52 g·L⁻¹、2.1±0.42 g·L⁻¹和1.9±0.03 g·L⁻¹。此前进行了一项类似的研究，但在该研究中，解脂耶氏酵母QU21在C/N 184时达到的脂质含量较低（1.48±0.27 g·L⁻¹）。在低氮培养基中观察到较高的脂质合成，但结果表明最佳摩尔C/N比范围为75~150。此外，在葡萄糖上培养解脂耶氏酵母时，高脂质生成菌株（基因修饰）的脂质生成与氮饥饿解偶联。较高的生物量含量与较高的脂质积累直接相关，这是任何微生物油脂生产的主要目标。
图2. C/N摩尔比对解脂耶氏酵母A101从纯甘油生产生物量（黑色柱）和脂质（灰色柱）的影响。显示了三组重复发酵的数据。误差棒代表标准偏差。
3.4. 评价解脂耶氏酵母A101从工业废物粗甘油生产脂质的能力
先前的实验表明，解脂耶氏酵母A101的最高脂质合成在C/N 75和C/N 100时达到。考虑到高浓度的杂质抑制细胞生长和甘油利用，对所有粗甘油批次进行了C/N比为75和100的摇瓶实验，以评估从这些底物合成脂肪酸和脂质的效率。所有结果列于表3和图3中。来自肥皂生产的粗甘油（G1）是在两种C/N比下生物量和脂质生产的最佳碳源。这一结果与使用Bioscreen C生长曲线分析仪的实验一致，在该实验中注意到G1具有更高的细胞密度。在该实验中，解脂耶氏酵母A101的生物量分别达到C/N 75时的7.8±0.01 g·L⁻¹和C/N 100时的6.8±0.21 g·L⁻¹。脂质含量为1.29±0.07 g·L⁻¹和1.69±0.09 g·L⁻¹。该生物量水平与从纯甘油获得的水平相似（图2）。在另一项研究中，在棕榈油厂废水上生长的解脂耶氏酵母菌株达到了相似的脂质含量（1.6~1.7 g·L⁻¹），但大多数评估的解脂耶氏酵母菌株在粗甘油上生长时无法达到相似的生物量和脂质产量。
有趣的是，注意到C/N比对其他粗甘油批次的脂质合成有影响。如图3所示，对G3和G5的脂质合成影响最大。在这两种碳源中，当应用C/N 75时，脂质合成较差。使用C/N 75的粗甘油G3，解脂耶氏酵母A101产生0.17±0.01 g·L⁻¹，但在C/N 100时，脂质产量达到0.27±0.01 g·L⁻¹。此外，注意到G5的脂质含量显著下降——从0.68±0.14 g·L⁻¹降至C/N 100和75时的0.15±0.02 g·L⁻¹。有趣的是，对于这两种碳源，生物量产量保持相似，它们与C/N比解偶联。
相反，对于甘油G2和G4，C/N比对生物量生产产生负面影响。然而，它仅对脂质合成产生轻微的抑制（图3）。来自生物柴油生产的粗甘油（G2~G4）的产量因批次而异，范围从0.17±0.01 g·L⁻¹到1.32±0.03 g·L⁻¹，与Bioscreen C实验（图1）一致，其中G3表现出最弱的生长。这一结果表明，并非所有来自生物柴油生产的粗甘油批次都是SCO生产的合适底物。这一观察与另一项研究一致，在该研究中只有基因修饰的解脂耶氏酵母菌株才能在粗甘油上有效生长。此外，对于所有测试的粗甘油批次，最佳结果在C/N 100时获得。鉴于这些结果，我们进一步在生物反应器中测试了SCO的生产，以放大该过程。
图3. C/N 75（A）和C/N 100（B）对粗甘油（G1~G5）生物量（黑色柱）和脂质（灰色柱）的影响。显示了三组重复发酵的数据。误差棒代表标准偏差。
| 符号 | G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 废产品来源[%]： | 肥皂生产（皂化） | 生物柴油 | 生物柴油 | 生物柴油 | 硬脂酸生产 | 纯（对照） |
| 甘油含量 | 80 | 50 | 87 | 80 | 42 | 100 |
| 氮含量 | 0.041 | 0.078 | 0.023 | 0.014 | 0.136 | 0 |
| NaCl | 7.59 | 3.04 | 0.20 | 5.47 | 1.23 | 0 |
| 灰分 | 8.76 | 3.62 | 0.93 | 6.34 | 1.35 | 0 |
| 水 | 3.6 | 43.42 | 11.85 | 8.16 | 55.3 | 0 |
表2 各种粗甘油批次中的元素含量。
| 粗甘油 | Cu | Mg | Fe | Zn | K | Na | Cl | Ca |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| G1 | 0.66±0.08 | 5.454±0.44 | 26.42±1.20 | 1.30±0.40 | 231.32±4.77 | 31632.89±521.66 | 46000±21.20 | 52.36±10.93 |
| G2 | 0.12±0.08 | 15.26±0.45 | 2.31±0.68 | 1.13±0.34 | 72.74±8.98 | 13102.66±519.93 | 18500±30.00 | 97.06±9.44 |
| G3 | 0.096±0.04 | 1.68±0.17 | 1.99±0.17 | 0.09±0.02 | 4388.16±174.37 | 442.85±9.70 | 1200±10.90 | 40.27±6.65 |
| G4 | 0.39±0.04 | 22.55±1.02 | 5.91±0.20 | 1.41±0.13 | 65.89±4.88 | 23120.03±764.10 | 33200±425.56 | 132.21±5.45 |
| G5 | 0.03±0.01 | 5.305±1.06 | 458.38±45.84 | 1.251±0.25 | 63.137±6.31 | 5224.84±261.24 | 7400±59.26 | 461.95±46.19 |
表3 解脂耶氏酵母A101在不同碳/氮比的含粗甘油（G1~G6）培养基中脂质（L）和生物量（X）生产的参数。
| 粗甘油 | X（g·L⁻¹） | L（g·L⁻¹） | YX/S（g·g⁻¹） | YL/X（g·g⁻¹） | YL/S（g·g⁻¹） |
|---|---|---|---|---|---|
| C/N 75 | |||||
| G1 | 7.80±0.07 | 1.29±0.07 | 0.167 | 0.166 | 0.028 |
| G2 | 6.07±0.06 | 1.09±0.02 | 0.163 | 0.180 | 0.029 |
| G3 | 2.87±0.06 | 0.17±0.01 | 0.246 | 0.059 | 0.015 |
| G4 | 6.63±0.15 | 1.32±0.03 | 0.155 | 0.198 | 0.031 |
| G5 | 3.00±0.20 | 0.15±0.02 | 0.184 | 0.051 | 0.009 |
| G6 | 8.47±0.02 | 2.31±0.53 | 0.188 | 0.273 | 0.051 |
| C/N 100 | |||||
| G1 | 6.87±0.21 | 1.69±0.09 | 0.140 | 0.249 | 0.035 |
| G2 | 3.67±0.06 | 0.65±0.04 | 0.113 | 0.180 | 0.020 |
| G3 | 2.4±0.26 | 0.27±0.03 | 0.090 | 0.112 | 0.010 |
| G4 | 3.83±0.25 | 0.93±0.18 | 0.101 | 0.243 | 0.025 |
| G5 | 2.47±0.15 | 0.68±0.14 | 0.100 | 0.280 | 0.027 |
| G6 | 7.97±0.23 | 2.06±0.42 | 0.160 | 0.260 | 0.031 |
YX/S——生物量产量；YL/X——来自生物量的脂质产量；YL/S——脂质产量。