摘要：目前微生物生长量的测定有多种方法。根据微生物的种类、形态特征、代谢特性等的差异可以选择不同的测定方法。以细菌、真菌、放线菌为主体，从微生物数量、微生物重量、群体生理指标三个方向出发，通过对三种类别微生物生长量测定常用方法的比较研究，总结各方法的优劣以及使用条件，为之后实验室里能够更加准确地依靠生长量测定某种特定微生物的生长曲线提供指导。
微生物生长曲线通常是指以微生物生长量为纵坐标，培养时间为横坐标所绘制的曲线。其是描述微生物生长状况的基本指标。一条典型的生长曲线可以分为延缓期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个生长时期[1]。处于对数生长期时，微生物生命力旺盛，世代时最短而稳定，细胞数量成倍地增加。所以对数期常用于发酵与微生物培养。处于稳定期时，微生物代谢产物大量产出并累积。生产应用中，可以通过延长稳定期来获得更多所需要的代谢产物。微生物生长量测定的准确度直接决定了其生长曲线测定结果的准确度，而准确地测定微生物生长曲线对于生产实践有着重大的指导意义。
目前微生物生长量的测定大致可以分为三类：微生物数量的测定，微生物重量的测定和群体生理指标的测定。测定微生物数量的方法包括显微镜直接计数法、稀释平板计数法、稀释培养计数法（最大概率法）、比浊法。测定微生物重量的方法主要指称重法。群体生理指标法指通过测定微生物群体所消耗的营养物质或者代谢产物来确定其微生物生长量，例如底物葡萄糖法、含氮量测定法、生物活性测定法等。在实验与实践生产中如何在众多方法中正确选择一种可以更加准确、简便地测定特定微生物的生长量是至关重要的。
1、微生物数量测定方法
1.1显微镜直接计数法
显微镜直接计数法是将适量待测微生物样品悬浊液置于一种特制的有固定面积和体积的计数板上，在显微镜下直接对微生物进行计数的快捷简便的方法。
目前实验室内主要有两类计数板，一般细菌可采用细菌计数板，菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板。两类计数板的原理、使用方法相同，只是较薄的细菌计数板使用油镜观察更佳[2]。在具体的实验过程中微生物悬浊液需要用无菌水稀释至适当浓度，以让每小格的菌数达到可以进行计数的范围内。依据每小格中微生物的数量换算成每毫升或每克菌液样品中的微生物数量，即生长量。该方法主要的缺陷是测得的是菌体总数，不能区分活死菌。针对这一缺陷，张霞等对微生物显微镜直接计数法进行点滴改进研究出了一种美兰水浸片法，通过使用0.1%美兰染液对酵母菌进行染色将死、活细胞区别开来从而降低计数的误差[3]。
1.2稀释平板菌落计数法
平板菌落计数法是以适当倍数稀释所测样品液至其中微生物分散成单个细胞，然后通过在适宜生长条件下固体培养基上形成单个菌落的数目来测定微生物数量的方法。在实际操作中，首先需要将样品液经过梯度稀释后取一定量均匀涂布在固体培养基上给予合适的生长条件倒置培养固定时间，最后对平皿上的菌落进行计数。此方法最重要的步骤是稀释，选取合适的稀释倍数可以减小误差提高测定的准确度。一般而言，在稀释过后，每个平皿中细菌、放线菌、酵母菌的菌落数在30～300个范围内，霉菌的菌落数在10～100个范围内。李华通过试验发现氧化还原染料TTC或章纳氏绿可使细菌与培养基间颜色对比鲜明，并有轻微的抑菌现象，使得各菌落的边缘明显，很少出现菌落交叉的现象，更适宜于观察计数[4]。由于该方法针对活菌计数准确度高这一特点，通常使用其它方法测定生长曲线时以该方法作为对照标准。
1.3稀释培养计数法
稀释培养计数法也称为最大概率法，其原理为数学概率统计法。首先需要对菌液进行十倍系列梯度稀释，直到稀释液接种到培养基上不出现或极少出现细菌生长，以出现生长的最低稀释度与没有出现生长的最高稀释度为基础，凭借“或然率”理论计算单位体积样品中近似菌数。一般每个稀释度的重复接种管数为3管，接种后需继续培养一定时段，之后确定三位数字的数量指标（原则为：最高稀释度中重复试管全部长菌的管数作为数量指标的第一个数字；再取后面两个稀释度中长菌的管数，作为余下的两个数字）。根据数量指标可从最大可能数表中查到最大可能细菌数从而确定生长量。
1.4比浊法
比浊法测定生长量的原理是以细菌悬浮液的生物量与悬浮液的混浊程度成正比为基础，利用紫外可见分光光度计测定的OD600值间接推断样品中微生物总量。实验过程大致为：（1）细菌样品的接种培养：接同样量的菌种子液于2-3瓶液体培养基中，并设置一空白样。之后将空白样和样品一同放置摇培箱进行培养。（2）测定OD值：设置仪器波长为600nm，以CK作为对照测定样品不同培养时间的菌液OD600值，若菌悬液浓度过大，需稀释适当倍数，使OD值在0.1～0.8，并记录培养时间、稀释倍数和OD600值[5]。朱艳蕾在对细菌生长曲线测定实验方法的研究表明，产红色素菌株AY9因为红色代谢物的积累导致生长曲线不但没有出现衰亡期，反而出现稳定期后又有增长趋势[6]，这说明代谢物颜色过深会严重影响吸光度。虽然比浊法省时省力，但是其原理并不适用于所有细菌，谢三磊等在对副鸡禽杆菌A、B、C三个血清型参考菌株的研究中发现在对数生长期和稳定期，菌液OD600值和活菌数之间并非线性关系，而是比较复杂的一元二次多项式回归关系[7]。
1.5几种数量测定方法的比较
2、微生物重量测定方法
微生物重量测定方法使用称重法。称重法是直接将菌体经过一定的处理后称取干重，以重量的变化来反映微生物生长量大小的方法。该方法普遍适用于放线菌与真菌，由于这两种菌属个体、形态、生长周期等特点与细菌相差较大，所以常用的细菌生长量测定方法不适用于这两者。大体步骤为：每个相应时间点分别设2～3个平行，在对应时间点取出菌液进行离心后将菌丝体洗涤干净（洗涤次数可为1～2次），之后再次离心、105℃烘干沉淀物至两次重量无差别，最后计算出平行试验的平均数即可。称重法原理简单但是操作复杂、干燥时间长、过程中造成的误差较大并且在实际生长曲线测定中很难确定样品何时进入衰亡期。
3、群体生理指标测定方法
3.1含氮量测定法
氮是蛋白质中稳定的主要成分，且微生物细胞中蛋白质含量很稳定。利用凯氏定氮法理论基础：蛋白质中的含氮量通常占其总质量的16%左右，而微生物中蛋白质含量又平均占细胞总质量的68%左右。在测得菌体含氮量后再算得蛋白质的总量之后进一步确定样品细胞的总质量即可确定其生长量[9]。大致步骤为：在有加速剂的条件下，用浓硫酸消化样品经过高温分解反应将有机氮都转变成铵盐，碱化后随水蒸气蒸馏出来的氨被过量的硼酸吸收，再以标准酸溶液滴定，就可计算出样品中的全氮含量，以全氮含量间接反映生长量的大小。当然，其它氮素测定法也可根据具体情况选择性使用。
3.2底物消耗法
碳源是微生物生长过程中必不可少的营养物质，以葡萄糖为例，我们可以根据样品微生物消耗的葡萄糖量来确定其生长状况。采用DNS法测定培养液中残留的葡萄糖含量，首先使用葡萄糖标准溶液配制工作曲线样液，在540nm波长下测定吸光度，得到工作曲线方程。将离心后的样品上清液进行稀释相应倍数，取部分于试管中，加入DNS试剂后用蒸馏水定容，测定其吸光度后求得上清液中葡萄糖含量。李鸿梅等在对罗耳阿太菌的生长曲线的测定研究中发现底物消耗法与称重法所测得的罗耳阿太菌的生长曲线都可以准确地显示出延缓期、对数期、稳定期的时间点，且相比之下，底物葡萄糖消耗法操作更加简单、数值更准确、更适合大型工业生产[10]。除了葡萄糖外，微生物生长过程中还需很多消耗物，实验者还可根据不同微生物特点从五大营养物质碳源、氮源、矿质元素、水、生长因子着手。
3.3生物活性法
目前世界上半数以上的抗生素都是放线菌产生的。所以依据其代谢物的抑菌效果，可以通过投放放线菌的目标作用菌于固体培养基中，在固定的时间测定抑菌圈的直径大小间接反映放线菌的生长量的大小。张红丹等在放线菌769生长曲线的测定中，发现用测抑菌圈直径法、比浊法、称取菌丝体干重法测定的放线菌769生长曲线和生物活性，变化趋势基本一致，证明了抑菌圈直径法的有效性[11]。该方法的适用条件较为局限，试验前需要知道样品菌种对哪种微生物的生长有抑制作用。
4、结语
基于微生物生长曲线下生长量的测定对于实验室微生物的深入研究与工业生产实践具有重要作用。测定微生物生长量并不局限于本文所列出的方法，但是从使用率与准确率来看，上述方法都是很实用的。单细胞细菌多使用数量测定法，在细菌不带深色且代谢产物影响较小的情况下又多使用比浊法。一般在使用除平板菌落计数法外的另外三种数量测定法所得结果都需要与平板菌落计数法的结果进行相关性分析来提高生长曲线的准确度。放线菌与真菌不常使用数量测定法（如放线菌菌丝较少较小也可以用OD法，不过误差比较大），测定多以重量测定法为主，以群体生理指标测定为辅。不管怎样，要根据实际情况与微生物的特征选择最合适的生长量测定方法来确定生长曲线。
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基金：扬州大学本科专业品牌化建设与提升工程项目(ZYPP2018C017);扬州大学2019年大学生学术科技创新基金项目.