Htt103Q形成需要Cmd1/Myo2/肌动蛋白相关焦点，需要Cmd1、Myo2和SEC基因进行母系偏向性分离
我们接下来测试了显著降低热诱导Hsp104相关聚集体母系偏向性分离的选定等位基因对Htt103Q不对称分离的影响。我们发现Cmd1和Myo2以及SEC基因（SEC18和SEC53）都需要用于Htt103Q的不对称分离（图5A）。与热诱导Hsp104相关聚集体一样，这种缺陷不是由于这些细胞中未折叠和不可溶Htt103Q水平升高所致（图5B）。热诱导Hsp104相关聚集体和Htt103Q的不对称分离需要相同因子，这有些出乎意料，因为前者在热应激时被隔离到不同的包涵体（IBs）、IPOD和JUNQ中，而Htt103Q在整个细胞质中形成多个小聚集体。然而，在IPOD/JUNQ形成之前，错误折叠的Hsp104相关蛋白组装成小应激焦点（也称为Q体或外周聚集体），类似于较小的Htt103Q聚集体。因此，我们测试了Hsp104-GFP是否在热应激后立即与Htt103Q共定位，发现情况确实如此；在约97.1%显示Htt103和Hsp104聚集体的细胞中可以观察到共定位（图5C），表明Htt103Q可能被隔离在终末稳定的应激焦点样结构中。
图5. Htt103Q聚集体与Cmd1/Myo2/肌动蛋白相互作用，并且其母细胞偏向性分离需要Cmd1、Myo2及SEC基因的参与。A. SIR2必需互作蛋白cmd1-1、myo2-14、sec53-6和sec18-1在诱导Htt-103Q聚集体形成时，其母细胞偏向性分离能力显著降低；负值表示无聚集体的子代细胞比例较野生型下降。不对称性数据以重复样本的平均值±标准差表示，与野生型相比的统计学显著差异采用非配对双尾t检验判定；星号表示样本间存在显著差异（*P<0.05）。B. 在用2%半乳糖诱导Htt103Q表达后，不同ts等位基因菌株中可溶性与不可溶性Htt103Q蛋白的相对含量与野生型细胞相比存在显著差异（统计分析采用非配对双尾t检验）。C. 代表性图像显示Hsp104- GFP（绿色）与Htt103Q-mRFP（红色）的共定位情况（黄色箭头指示）：细胞经42°C热激处理后，在30°C恢复30分钟，约97.1%的细胞中可见这两种聚集体共存。D. 使用硫黄素-T对携带Htt103Q聚集体的细胞进行淀粉样染色（右列）；左列显示表达Rnq1-mRFP的细胞图像作为淀粉样蛋白聚集体的阳性对照。E.Htt103Q-mRFP聚集体与研究中确定的、对母系偏倚分离至关重要的特定蛋白质存在共定位现象。上两组图显示，在同时存在mRFP标记聚集体和 GFP 标记结构的细胞中，Cmd1- GFP 与Myo2- GFP 结构均与Htt103Q-mRFP聚集体发生重叠并共定位（分别有94.4%和92.2%的细胞显示Htt103Q-mRFP与Cmd1及Myo2结构共定位）。下两组图表明，仅有少数细胞（48%）出现Htt103Q-mRFP与Sec18- GFP 的共定位；而Sec53- GFP 与Htt103Q-mRFP聚集体之间则完全未观察到共定位。F. 与Hsp104Y662A- GFP（绿色）结合的热变性蛋白（而非亨廷顿病蛋白Htt103Q-mRFP（红色））形成病灶需要Hsp42的参与。上图：野生型细胞；下图：hsp42D突变体细胞。G. 对野生型与hsp42D细胞中Hsp104Y662A及Htt103Q聚集体形态变化的定量分析：从显示聚集体的Z轴堆栈图像中统计了超过100个细胞，并将其分为三类（第1类：含1个聚集体；第2类：含2个聚集体；第3类：含3个及以上聚集体）。比例尺=5毫米。
有人提出淀粉样蛋白和热变性蛋白被隔离到空间上不同的质量控制位点。因此，我们使用硫黄素-T染色测试Htt103Q是否形成淀粉样蛋白，但未发现证据，而阳性对照Rnq1-mRFP聚集体容易用硫黄素-T染色（图5D）。接下来，我们分析了Htt103Q焦点是否与Cmd1和/或Myo2共定位，这可以直接从物理上解释为什么母细胞中的滞留依赖于这些因子。在Cmd1或Myo2富集于可见结构的细胞中，94.4%和92.2%分别显示Htt103Q与这些Cmd1或Myo2结构共定位（图5E）。此外，ATPase缺陷型Hsp104（Hsp104Y662A）先前被证明"锁定"在应激焦点阶段，同样与Cmd1（74.4%的细胞）和Myo2（56.6%的细胞）富集结构共定位。我们发现Htt103Q焦点与Sec18之间的共定位较少（约48%显示Sec18结构和Htt103Q焦点的细胞），而Htt103Q焦点与Sec53之间未观察到明显的共定位（显示弥散信号）（图5E）。相反，在具有热诱导Hsp104Y662A焦点的细胞中，可以观察到Hsp104Y662A和Sec53之间的明显共定位（82.7%）。
一些Htt103Q和Hsp104Y662A焦点似乎位于内质网附近，如通过Rtn1-GFP共染色检测到的那样。先前研究表明，小热休克蛋白Hsp42影响错误折叠蛋白的隔离；具体而言，在缺乏Hsp42的情况下，错误折叠蛋白主要被导向近核JUNQ沉积位点，而不是外周的、远离细胞核的聚集位点。重要的是，我们发现缺乏Hsp42将Hsp104Y662A重定向到包涵体（具有1或2个聚集体的细胞，即1类和2类细胞），而不是外周聚集体/应激焦点（3个或更多聚集体；3类细胞），而Htt103Q焦点的形成未改变（图5F和G）。与DAPI共染色表明，hsp42缺失突变型中具有单个近核定位聚集体的细胞数量增加。这些数据表明，虽然Hsp104Y662A和Htt103Q被导向重叠的、Cmd1/Myo2相关的焦点，但用于将热诱导应激焦点和Htt103Q隔离到这些位点的途径/因子可能不同。
Cmd1和Myo2与肌动蛋白细胞骨架密切相关，蛋白聚集体和朊病毒先前被发现存在于肌动蛋白富集结构丰富的区域，使用邻近连接分析和共定位荧光显微镜。然而，常规荧光显微镜的一个主要缺点是x-y轴向分辨率限制在约250 nm，z轴向分辨率限制在约500 nm。因此，为了更精确地分析蛋白聚集体/应激焦点与肌动蛋白细胞骨架之间的空间关系，我们进行了超分辨率三维结构照明显微镜以分析可能的聚集体和肌动蛋白细胞骨架体内相互作用。
使用该技术，与常规显微镜相比，可以分辨约8倍小的体积，相当于x-y约100 nm和z轴约200 nm。3D-SIM分析揭示，Htt103Q和Hsp104Y662A焦点都沿着肌动蛋白纤维排列，在某些情况下缠绕在纤维上（图6A-D）。在此分辨率下，使用多个Z堆栈，很明显共定位不是由于肌动蛋白寡聚体存在于聚集体本身中（图6B和D）。此外，我们发现Hsp104Y662A-mCherry应激焦点与肌动蛋白纤维相关蛋白Abp140-3GFP显示相当大的共定位，进一步支持应激焦点与肌动蛋白纤维之间的关联（图6E和F）。
图6. 超分辨率三维结构照明显微镜（3D-SIM）显示Htt103Q与Hsp104相关的应激焦点与肌动蛋白细胞骨架的关联关系。A&B：3D-SIM图像表明Htt103Q- GFP（绿色通道）聚集体与肌动蛋白细胞骨架（红色通道：Alexa Fluor 568鬼笔环肽）相互结合；蓝色箭头标示聚集体与肌动蛋白细胞骨架紧密邻接的区域。C：热休克处理后Hsp104Y662A- GFP 应激焦点的3D-SIM分析显示，Hsp104Y662A- GFP 相关焦点（绿色通道）沿肌动蛋白纤维束（红色通道：Alexa Fluor 568鬼笔环肽）排列，并在某些位置环绕纤维束（黄色箭头）。D：Hsp104Y662A- GFP 、Alexa Fluor 568鬼笔环肽及融合通道的Z轴堆栈序列图像，采集时采用100 nm光学层厚；黄色箭头指示聚集体（绿色）与肌动蛋白纤维束（红色）紧密相邻或环绕其周围的位点。E&F：3DSIM显微镜显示蛋白质聚集体（Hsp104Y662A-mCherry，红色）与Abp140-3GFP（绿色）肌动蛋白纤维束结合蛋白相互作用。全细胞图像比例尺为0.5 mm，放大图像比例尺为0.2 mm。