摘要
革兰氏阴性菌嗜麦芽窄食单胞菌生存于多种生态位。由于其强大的生物膜形成能力和对多种抗生素的耐药性，该菌也是一种医院感染病原体，对免疫系统受抑制或受损的患者健康构成严重威胁。除了组氨酸激酶RpfC，双组分信号转导系统（TCS）是大多数细菌病原体使用的典型调控机制，但从未在嗜麦芽窄食单胞菌中进行过实验研究。在此，我们在嗜麦芽窄食单胞菌基因组中注释了62个推定的组氨酸激酶基因，并通过系统性插入失活成功获得了51个突变体。表型鉴定发现了一系列在细菌生长、游动能力和生物膜形成方面存在缺陷的突变体。一个TCS，在此命名为BfmA-BfmK（Smlt4209-Smlt4208），被遗传学证实可调控嗜麦芽窄食单胞菌中的生物膜形成。结合相互作用伙伴预测和染色质免疫沉淀筛选，鉴定出六个在体内被BfmA结合的候选启动子区域。我们证明，其中BfmA作为一个转录因子，直接结合到bfmA-bfmK操纵子和Smlt0800（acoT）的启动子区域，并正向调控它们的转录。acoT编码一种与生物膜发育相关的酰基辅酶A硫酯酶。组氨酸激酶基因的基因组规模突变分析和BfmK-BfmA在生物膜中调控的功能解析，为支持更深入研究嗜麦芽窄食单胞菌的细胞信号传导提供了遗传信息，从而为开发抗击这一重要细菌病原体的新方法奠定基础。
组氨酸激酶（HKs）是大多数细菌用来检测和响应环境刺激的双组分信号转导系统（TCSs）的细胞传感器。除少数细菌物种（如支原体属）外，细菌细胞通常编码几个到数百个TCSs，其拥有的TCS总数是细菌适应各种生态位能力的隐喻，即细菌的智商（IQ）。典型的TCS由一个膜结合的HK和一个细胞质应答调节因子（RR）组成。在监测到特定刺激后，HK通过水解ATP使自身自动磷酸化，并将磷酸基团转移到二聚化和组氨酸磷酸转移（DHp）结构域内一个保守的组氨酸残基上。接着，磷酸基团被转移到其同源RR的N端接收器结构域内的一个保守天冬氨酸残基上。此后，激活的RR根据其C端输出结构域的生化特性控制下游基因表达、细胞行为或酶活性。因此，细菌在复杂环境中生存的能力很大程度上取决于其HK库的数量、结构和调控功能。在感染的背景下，一些HKs（例如PhoQ、QseC和SaeS）是细菌病原体毒力因子表达的典型调节因子。TCSs由原核生物、粘菌、真菌和植物的基因组编码。然而，在动物的任何蛋白质组中均未发现TCSs。因此，HK是开发针对细菌病原体的新型抗生素的潜在理想分子靶点。
在过去的30年里，革兰氏阴性致病菌嗜麦芽窄食单胞菌已逐渐成为医院中因免疫缺陷疾病或长期抗生素治疗而免疫抑制患者的严重机会性病原体。这种病原体在此类免疫缺陷患者中引起致命性疾病，如肺炎、尿道炎、脑膜炎和血流感染。治疗嗜麦芽窄食单胞菌感染的一个困难是，该菌的大多数分离株具有强大的生物膜形成能力，例如在输液管、留置血管内装置、医疗器械、水管和宿主组织表面。这些细菌聚集体是感染源，并且很难有效清除。此外，嗜麦芽窄食单胞菌基因组编码多种多药外排泵和其他分子机制，增强了该菌对各种抗生素的耐药性。由于这些原因，嗜麦芽窄食单胞菌已成为人类健康的严重威胁。一些研究估计，在报告的医院感染病例中，高达77%的死亡率可能归因于嗜麦芽窄食单胞菌感染。为了对抗嗜麦芽窄食单胞菌，基于靶向生物膜形成和毒力因子表达调控的新疗法或抗菌剂的开发是可取的。然而，TCS调控作为可能被新型抗菌剂靶向的核心分子机制之一，在嗜麦芽窄食单胞菌中缺乏适当的研究。实际上，只有HK RpfC（负责在近缘细菌黄单胞菌属中调节细胞间通讯和毒力因子表达）被证明在嗜麦芽窄食单胞菌中控制扩散信号因子（DSF）触发的调节。我们之前的研究鉴定出FsnR，一个控制鞭毛基因转录和生物膜形成的孤儿RR，但FsnR的同源HK仍不清楚。
在本研究中，我们对嗜麦芽窄食单胞菌中所有参与控制生物膜形成的HK基因进行了系统的突变研究。在62个推定的HK基因中，我们通过同源单交换事件的载体整合方法获得了51个插入突变体。表型鉴定发现了一系列参与细菌生长、游动能力和生物膜发育的HK基因。其中，一个由双顺反子操纵子编码的TCS，命名为BfmA-BfmK（Smlt4209-Smlt4208），被遗传学证实可调节细菌细胞聚集。BfmK是一个具有自动激酶活性的典型HK，而BfmA作为一个转录因子，结合bfmA-bfmK操纵子的启动子区域以自动调节其自身表达。此外，BfmA结合Smlt0800的启动子区域以正向调节其转录。该基因编码一种酰基辅酶A（acyl-CoA）硫酯酶（命名为AcoT），与生物膜发育相关。组氨酸激酶基因的基因组规模突变分析和BfmA-BfmK系统在生物膜形成中的功能重要性提供了关于嗜麦芽窄食单胞菌HKs的遗传信息，以促进未来对这种细菌病原体细胞调控的研究。
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