3.6. RASV株的安全性评估
口服接种后使用SCID Beige小鼠评估疫苗株χ12042(pYA5383)和χ12094(pYA5383)的安全性。接受0.65×10⁹ CFU不表达重组抗原的对照株χ12042(pYA3620)的小鼠（n=6）显示100%存活。同样，接种1.19×10⁹ CFU χ12094(pYA5383)组（n=8）也显示零死亡率（图4）。然而，给予1.17×10⁹ CFU χ12042(pYA5383)的75%小鼠（n=8）在60天观察期结束时存活，给予1.1×10⁹ CFU χ12042(pYA3841)的50%小鼠（n=8）在接种后50天内死亡（图4）。χ12042(pYA5383)或χ12042(pYA5383)的存活率低于χ12042(pYA3620)和χ12094(pYA5383)，但统计分析无显著差异（图4）。上述数据看起来有些前景，因为χ12094(pYA5383)在免疫缺陷小鼠中被发现是安全的。然而，在χ12042中使用质粒pYA5383和pYA3841获得的存活结果需要进一步减毒这些菌株，以便将来用于免疫受损受试者。
图4. RASV株在SCID小鼠中的安全性评估。口服给予单剂量10⁹ CFU的χ12042(pYA3620)、χ12042(pYA3841)、χ12042(pYA5383)或χ12094(pYA5383)给SCID小鼠（B、T和NK细胞缺陷）。这些小鼠被观察60天，记录死亡率和发病率迹象。各组之间无显著差异（Log-rank (Mantel-Cox)）。
4. 讨论
基于rF1和rLcrV抗原的亚单位疫苗已通过I期和II期临床试验，但疫苗未能保护非洲绿猴免受肺鼠疫，这对其保护人类的能力提出了质疑。然而，从天然来源分离的F1阴性鼠疫耶尔森菌株在小鼠和吸入这些F1阴性和/或F1阳性鼠疫耶尔森菌株的非洲绿猴中引起实验性致死疾病，与原发性肺鼠疫一致。鼠疫耶尔森菌易于基因操作以创建缺乏高免疫原性特征（F1⁻鼠疫耶尔森菌）的菌株。Δcaf1鼠疫耶尔森菌不仅在腺鼠疫和肺鼠疫动物模型中完全毒力，而且突破了用鼠疫耶尔森菌减毒活株或F1亚单位疫苗产生的免疫应答。此外，针对LcrVᴰ²⁷产生的抗体无法阻断耶尔森菌肠杆菌株的III型注射，但幸运的是不允许表达lcrVᵂ²²⁷⁰³或lcrVᵂᴬ⁻³¹⁴的鼠疫耶尔森菌株在静脉攻击模型中逃避LcrV介导的鼠疫保护性免疫。然而，维持III型分泌途径功能属性的lcrV多态性可能导致逃避鼠疫保护性免疫的变异株。因此，仅将F1和LcrV组合用于人类疫苗可能不足以保证人类对鼠疫的长期防御。
同样，仅由沙门氏菌呈递的LcrV和F1可能不足以对抗武器化或天然存在的鼠疫耶尔森菌，这促使我们评估其他抗原。除LcrV和F1外，我们研究中还通过沙门氏菌分别递送了六种其他鼠疫耶尔森菌抗原，即Psn、HmuR、PsaA（pH 6抗原）、YadC、Pla和YopE。然而，只有用递送Psn或YadC的RASV免疫提供了对鼠疫耶尔森菌攻击的部分保护。然后，当使用RASV株递送时，LcrV、F1、Psn和YadC的池显示了多种抗原（LcrV、F1和Psn）在增强对鼻内和皮下鼠疫耶尔森菌CO92攻击保护性免疫方面的协同效应，但YadC与LcrV的组合没有（未发表数据）。上述原因之一是YadC的毒性，另一个原因可能是单个RASV细胞合成和递送太多抗原，阻碍了RASV株的生长并进一步导致其免疫原性降低。我们小组最近的工作表明，用两种RASV混合物免疫，一种递送产气荚膜梭菌α毒素的羧基末端片段，另一种递送GST-NetB融合蛋白，可诱导肉鸡对产气荚膜梭菌的保护性免疫。类似方法可应用于两种RASV的混合物，一种递送LcrV、F1和Psn抗原，另一种递送另一种鼠疫耶尔森菌保护性抗原，如YopD、YscF、Ail或YadC，以诱导最佳保护性免疫。
免疫递送LcrV-196、Psn和F1的χ12094(pYA5383)和递送LcrV-196和Psn的χ12042(pYA5383)在小鼠中产生与免疫递送单一LcrV196的对照株χ12042(pYA3841)相似数量的抗LcrV抗体（图2），但免疫χ12094(pYA5383)对皮下和鼻内高致死剂量鼠疫耶尔森菌CO92攻击提供了显著更高的保护，这表明递送Psn和F1与LcrV协同增强了抗鼠疫保护性免疫。Fetherston等人表明，Δpsn鼠疫耶尔森菌株在小鼠腺鼠疫和肺鼠疫模型中的LD₅₀分别为>2.6×10⁷ CFU（比野生型鼠疫耶尔森菌LD₅₀高1×10⁶倍）和1.1×10⁴ CFU（比野生型鼠疫耶尔森菌LD₅₀高100倍）。而免疫χ12042(pYA5383)对皮下高致死剂量鼠疫耶尔森菌CO92攻击提供较少保护，但对鼻内高致死剂量攻击提供更好保护。目前的理解尚不清楚。此外，与χ12042(pYA5383)和χ12042(pYA3841)相比，χ12094(pYA5383)在免疫缺陷小鼠中被发现相当安全（图4），尽管安全性评估中无统计学差异。基于鼠伤寒沙门氏菌疫苗株的研究，我们将把相同的完善基因型印入甲型副伤寒沙门氏菌，作为递送多种保护性抗原的I期临床试验疫苗。
总之，基于鼠伤寒沙门氏菌的三价活疫苗在小鼠中对腺鼠疫和肺鼠疫提供显著高保护，显示出作为下一代鼠疫疫苗的前景。此外，本文开发的策略提供了使用RASV作为疫苗平台构建有效对抗多种人类病原体的多价疫苗的潜力。
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