3.2. 携带单一Asd⁺质粒合成多种抗原（LcrV196和Psn）的RASV株
在高拷贝数质粒（pBR ori）中合成Psn有一定毒性。通常我们在低拷贝质粒（p15A ori）pYA3996中表达psn。质粒pYA3841是一种pBR ori Asd⁺质粒，编码bla-SS-lcrV196-CT融合，其中lcrV196序列的N端与β-内酰胺酶的N端分泌信号序列（SS）融合，LcrV196的C端与β-内酰胺酶的C端22个氨基酸融合。携带pYA3841的RASV株免疫可诱导对毒力鼠疫耶尔森菌攻击的统计学显著保护。为了递送多种抗原，我们构建了含Plpp-lacO-2-psn（Plpp-lacO-2在psn起始密码子前含有6个额外碱基以减少Psn合成）和Ptrc-bla ss-lcrV196-bla CT同向转录的pBR ori质粒pYA5383（图1A）。将pYA5383引入χ12042后，LcrV196和Psn均得到最佳产生，且不影响细菌生长（图1B和D）。在χ12094(pYA5383)中合成的LcrV196、Psn和F1也未显示对细菌生长的不良影响（图1C和D）。此外，携带不同质粒的RASV株的生长不依赖于初始稀释率（1:1000或1:10000）（图S1A和D）。
图1. 重组鼠伤寒沙门氏菌疫苗株递送多种鼠疫耶尔森菌抗原。（A）Asd⁺载体pYA5383表达lcrV196（编码截短LcrV，氨基酸131至326）和psn。（B）Western blot显示不同RASV株χ12042(pYA3620)、χ12042(pYA5383)和χ12094(pYA5383)中LcrV196和Psn的存在。M，标记分子量标准。（C）Western blot显示不同RASV株χ12042(pYA5383)和χ12094(pYA5383)中F1的存在。F1单体分子量为17kDa。（D）携带不同质粒的RASV株生长曲线测定。每种菌株的3ml过夜培养物稀释1:1000到250μl预热补充0.05%阿拉伯糖和0.1%甘露糖的LB培养基中，使用Bioscreen C MBR 37°C培养。250μl培养体积以三份加入蜂窝多孔板。Bioscreen读数器设置为以30分钟间隔测量培养物在OD600nm的光密度，培养温度37°C，持续24小时。
3.3. LcrV196、Psn和F1的合成与稳定性
通过将χ12042和χ12094表达pYA5383的lcrV196和psn在补充0.05%阿拉伯糖和0.1%甘露糖的LB肉汤中培养，检查其表达谱。携带空载体的χ12042未产生任何与抗LcrV、抗Psn或抗F1抗体反应的蛋白质。在总细胞提取物中，约25kDa分子量的蛋白质条带与抗LcrV抗体反应。Psn（分子量73.7kDa）和F1（17kDa）也可通过兔抗Psn血清或小鼠抗F1血清的免疫印迹在全细胞裂解物中检测到。此外，当菌株按第2节所述在LB肉汤中培养时，所有三种蛋白质的合成稳定维持50代或更多。
3.4. 重组抗原的血清抗体反应
口服接种递送重组抗原的RASV株后，除χ12042(pYA3620)组外，所有组小鼠均产生针对每种抗原的显著IgG血清抗体，在免疫后约28天达到峰值。免疫χ12042(pYA3841)、χ12042(pYA5383)和χ12094(pYA5383)在免疫后第2周和第4周均表现出比χ12042(pYA3620)显著更高的抗rLcrV IgG滴度（图2A）。免疫χ12042(pYA5383)和χ12094(pYA5383)诱导了比χ12042(pYA3620)显著更高的抗Psn IgG滴度（图2B）。只有免疫χ12094(pYA5383)也产生了显著高的抗F1 IgG滴度（图2C）。所有抗原表达组均发现高抗体亚型滴度（IgG1和IgG2a）（图S2）。然而，尽管相应滴度显著高于对照株χ12042(pYA3620)，但三种重组抗原的IgG1和IgG2a亚型之间无显著差异。
图2. 通过ELISA测定对重组LcrV、Psn和F1的抗体反应。数据表示各组10只小鼠口服免疫BSG、χ12042(pYA3620)、χ12042(pYA3841)、χ12042(pYA5383)或χ12094(pYA5383)后在指定免疫后周数诱导的IgG抗体水平。（A）对LcrV的总IgG反应。（B）对Psn的总IgG反应。（C）对F1的总IgG反应。误差线表示标准差。，P < 0.0001。10只小鼠的血清分别个体检测。
3.5. 抗鼠疫耶尔森菌攻击的保护
小鼠口服接种不同RASV株，然后按第2节所述程序通过皮下或鼻内途径用致死剂量鼠疫耶尔森菌CO92攻击。免疫递送染色体编码的耶尔森菌抗原LcrV-196、Psn和F1的χ12094(pYA5383)为小鼠提供完全保护，抵抗约570 LD₅₀鼠疫耶尔森菌CO92的皮下攻击，而免疫递送LcrV-196和Psn的χ12042(pYA5383)或仅递送LcrV-196的阳性对照χ12042(pYA3841)对相同剂量皮下攻击分别提供50%或70%保护（图3A）。对于肺鼠疫保护，χ12094(pYA5383)或χ12042(pYA5383)免疫分别为小鼠提供60%或40%保护，抵抗50 LD₅₀鼠疫耶尔森菌CO92的鼻内攻击，显著高于χ12042(pYA3841)免疫（图3B）。所有接种BSG或对照株χ12042(pYA3620)作为阴性对照的小鼠在皮下和鼻内攻击后均死亡（图3A和B）。
图3. 经口服接种表达针对鼠疫耶尔森菌抗原LcrV、Psn或F1的 RASV 株后， BALB /c小鼠的保护效力。每组10只 BALB /c小鼠分别口服接种：不含抗原的阴性对照（1×10⁹ CFU 12042(pYA3620)）、携带LcrV196的阳性对照（12042(pYA3841)）、同时携带LcrV196和Psn的疫苗（12042(pYA5383)），以及同时携带质粒编码的LcrV196/Psn与12094染色体编码的F1抗原的疫苗（12094(pYA5383)）。第二次免疫后第4周对小鼠进行攻毒，并在攻毒后15天内监测死亡率。(A)通过皮下注射给予5700 CFU（约570 LD₅₀）强毒力鼠疫耶尔森菌CO92株进行攻毒。12094(pYA5383)疫苗接种组与pYA3620组及 BSG 组等对照组均存在显著差异（P < 0.0001）；该组与12042(pYA5383)组亦存在显著差异（P = 0.0136）。(B)通过鼻内注射给予5000 CFU（约50 LD₅₀）强毒力鼠疫耶尔森菌CO92株进行攻毒。12094(pYA5383)疫苗接种组与pYA3620组及 BSG 组等对照组均存在显著差异（P < 0.0001）；该组与12042(pYA3841)组亦存在显著差异（P = 0.0156）。
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