2.3. 模拟
使用公式(1)分析T_det检测时间分布对四个（或多或少随机的）变量N₀、N_det、μ和λ（其分布取决于N₀）的依赖性。模拟研究在Excel中进行，并使用@Risk进行分析，输入如下：
每孔的初始细胞数遵循平均值为1个细胞/孔的泊松分布；
单细胞的滞后时间λ(1)假设为Gamma分布，遵循Baranyi和Pin的理论。Gamma函数由两个参数α和β定义。在最佳生长条件下（30°C，pH 7，0.5% NaCl），α取5，β=0.5小时，导致预期滞后时间平均值为2.5小时（注意2.5小时是单细胞滞后时间的平均值，与群体滞后时间不同），标准偏差为1.12小时。当每孔多于一个细胞时，滞后时间由Baranyi和Pin推导的公式估计。使用与公式(1)相同的符号：
比生长速率假设遵循正态分布，平均值为1 h⁻¹，标准偏差为0.03 h⁻¹。这对应于约3%的相对偏差，这是通过生成独立重复活菌计数生长曲线确定的。图2显示了在最佳条件下培养的四个此类曲线。在较不利的的环境条件下也生成了类似的曲线。它们表明最大比生长速率是一个很好可重复的参数，在支持生长的环境中误差范围为15%。
图2. 可存活细胞计数生长曲线的重复实验结果。比生长速率是一个高度可重复的参数，其相对标准误差小于3%。
检测水平的细胞数分布假设为均匀分布，介于5×10⁶和1.5×10⁷细胞/ml之间。
3. 结果与讨论
3.1. 模拟
使用蒙特卡洛抽样方法进行一万次迭代，得到T_det检测时间的标准偏差为1.25小时，而个体滞后时间的偏差为1.12小时。在方差分析（ANOVA）术语中，1.12²/1.25² = 80%的检测时间方差可由滞后时间的方差解释。注意，此模拟中滞后时间的变异性相对较小。如果细胞受到胁迫，它们的滞后时间会更加分散，个体滞后时间变异性对总体变异性的贡献将变得更加主导。
模拟的T_det检测时间保持了Gamma分布的形状。将@Risk中所有可用的分布（对数正态等）拟合到T_det值。Gamma分布给出了良好的拟合，卡方值高达93%。T_det的方差略高于个体滞后时间的方差。
得出结论，Gamma分布适合拟合T_det值的分布，并且检测时间的大部分变异性可以归因于滞后时间的变异性。
模拟还表明，获得检测时间分布良好估计所需的阳性孔数约为100。
3.2. 实验结果
图3. 在30 J·C、pH 7及0.5%氯化钠条件下培养的样品检测时间（小时）的观测值与拟合分布。柱状图：观测检测时间的直方图；连续曲线：通过最大似然法对数据进行伽马分布拟合后生成的频率分布。
Gamma分布被证明适合拟合测量的T_det检测时间（图3）。这与Wu等人的发现不一致，他们将正态分布拟合到单个细胞滞后时间的分布。然而，他们报告了每种稀释度40个重复，根据我们的经验，这不足以确定哪种分布最佳。
在Bioscreen微孔板的200个孔中，阳性孔的平均数量始终在125到175之间。基于泊松假设，这意味着在所有实验中N₀的平均值在1到2之间。
我们已经确定检测时间变异的主要来源是由于个体滞后时间的变异性。为了测试生长条件效应的一致性，在每种环境条件下进行了两到三次重复实验。一组环境条件下检测时间的总方差被分为三个独立的方差：
V_Total = V_R + V_E + V_H
其中：(i) V_R是由于Bioscreen读数不准确性；(ii) V_E是由于环境条件效应的变异性；(iii) V_H是由于接种时细胞生理状态的异质性。这是由检测时间分布测量的（其主要来源是个体滞后时间的变异性）。
Bioscreen读数不准确性V_R通过高水平接种实验评估，并假设在任何环境条件下都相同。由于环境条件的变异性V_E是在相同条件下进行的实验中检测时间均值的方差。均值用检测时间的标准偏差加权。最后，由于群体异质性的变异性V_H通过从前者方差中减去平均总方差获得。结果以R²百分比表示，即在给定环境条件下接种时细胞生理状态异质性导致的总变异比例（表1）。在大多数情况下，环境条件的重复是令人满意的（由于群体异质性导致的变异性高于95%）。然而，在pH 5.0或5.5下进行的实验并非如此；在这些低pH值下，结果不能一致地重复。
表1 不同环境条件下检测时间的变异性来源
主要来源通常是接种时细胞初始生理状态的异质性V_H，除了在低pH时，环境因子效应的变异性V_E可能具有同等权重。
图4. 所有研究生长条件下检测时间分布的标准偏差与其平均值的关系。
正如预期的那样，生长条件越抑制，检测时间越长，其分布越分散。在图4中，绘制了每种生长条件下检测时间的标准偏差与其平均值的关系。可以看出，在研究的环境因素区域内，检测时间的标准偏差与平均值之间的关系大致呈线性。然而，值得注意的是，在4% NaCl时，标准偏差几乎与0.5% NaCl时保持在同一水平，然后才开始增加。这与Patchett等人的结果一致，他们发现随着NaCl浓度增加，钾和甜菜碱等渗透保护剂在细胞中的积累从约5%的NaCl浓度开始显著增加。
4. 结论
控制致病菌滞后时间的变异性以生产例如最低限度加工食品等安全食品是可取的。然而，技术上很难获得关于单个细胞滞后时间足够且足够准确的数据。浊度检测时间可能提供处理该问题的方法。正如我们所展示的，如果初始细胞数较低，检测时间变异的主要来源接近个体滞后时间的变异性。作为第一近似，可以在检测时间与其标准偏差之间建立线性关系dev(T)∝T。然而，如果生长缓慢，其他来源（"噪声"）可能与原始变异比例相当，线性关系可能不容易建立。
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