研究简介
本研究旨在系统解析肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）在携带者、化脓性肝脓肿患者与肺炎患者三类来源中的种群结构、基因组特征及致病差异。研究共收集2013—2020年中国9省份的232株临床分离株（携带者38株、肝脓肿124株、肺炎70株），经全基因组测序与多位点序列分型（MLST）划分为74种ST型，发现不同来源菌株拥有各自优势克隆：肝脓肿以ST23为主（占41.94%），肺炎以ST11为主（占54.29%），ST29、ST65、ST86、ST367、ST700仅见于肝脓肿，ST15、ST45、ST383仅见于肺炎，提示来源间克隆重叠有限。核心基因组SNP构建的系统发育树与泛基因组主成分/PLS-DA分析均能将菌株划分为三个与来源对应的系统发育组，证实携带、肝脓肿、肺炎来源菌株具有 distinct 的基因组特征。
毒力因子分析显示，肝脓肿株携带显著更多的气杆菌素、沙门菌素、耶尔森菌素、尿囊素代谢等相关基因，其中沙门菌素与肝脓肿关联最强——93/97（95.88%）肝脓肿ST携带该因子，而52/53（98.11%）肺炎ST不携带。与之相反，肺炎株携带显著更多的耐药基因与质粒复制子（尤以IncF、repB、IncH多见），反映其在医院/社区高抗生素压力下的耐药播散特征。表型验证中，肝脓肿株虽生物膜形成能力较弱、生长速率与黏附无显著差异，但对HepG2细胞的细胞毒性更高，小鼠腹腔感染模型1天后肝脏菌载量显著高于肺炎株与携带者株，且肝脓肿株感染小鼠呈现"肝＞肺"的器官偏好，与临床肝脓肿表型吻合。研究结论指出，不同来源肺炎克雷伯菌对应不同进化分支与感染来源，沙门菌素在肝脓肿致病中的具体机制值得进一步探究。
Bioscreen 全自动生长曲线分析仪的应用
Bioscreen C全自动生长曲线分析仪用于动态监测肺炎克雷伯菌的生长动力学以评估基础增殖能力差异。研究人员筛选了31株兼具来源代表性与流行序列型覆盖度的肺炎克雷伯菌代表株，包括5株携带者来源、17株化脓性肝脓肿来源（含肝脓肿参考株NTUH-K2044）、9株肺炎来源（含肺炎参考株ATCC BAA-2146），且覆盖ST11、ST15、ST23、ST29、ST65等本研究检出的优势流行型。实验将对数期菌液按1:100稀释接种LB肉汤培养24小时，每间隔1小时用Bioscreen C检测一次培养液在600nm波长下的光密度值（OD600）绘制生长曲线。最终检测结果显示三类来源菌株的生长速率无统计学显著差异，该结果为后续毒力表型分析排除了“基础增殖能力不同”的混杂干扰，也说明本研究中观察到的肝脓肿来源菌株体内毒力更强、肺炎来源菌株耐药负荷更高等分化特征，并非源于基础生长能力的差异，而是与菌株所属进化分支的功能基因携带模式分化直接相关。
实验结果
不同来源菌株的种群结构存在明显分化，MLST共检出74种ST型，肝脓肿株以ST23为绝对优势型（占41.94%）、肺炎株以ST11为优势型（占54.29%），ST29、ST65、ST86、ST367、ST700仅见于肝脓肿，ST15、ST45、ST383仅见于肺炎，核心基因组SNP系统发育树与泛基因组多元分析均可将菌株划分为3个与来源对应的系统发育组，且携带者株ST分布离散，提示三类来源菌株属于不同进化分支、感染来源可能相互独立。
功能基因层面，肺炎株携带的耐药基因、质粒复制子（以IncF、repB、IncH为主）数量显著多于另外两类菌株，与肺炎株多经院内/社区高抗生素压力环境传播、更易获得耐药基因水平转移的特征相符；肝脓肿株则携带显著更多的毒力相关基因，包括气杆菌素、耶尔森菌素、colibactin、RmpA、KfuABC及尿囊素代谢相关基因，其中沙门菌素（salmochelin）与肝脓肿来源株的关联极强，95.88%的肝脓肿相关ST携带该因子，而98.11%的肺炎相关ST不携带该因子。
表型验证显示三类菌株基础生长速率无显著差异，肝脓肿株生物膜形成能力反而弱于另外两类，但对HepG2细胞的细胞毒性显著更高，小鼠腹腔感染模型中肝脓肿株感染小鼠的肝脏细菌载量显著高于其余两组，且呈现“肝>肺”的器官定植偏好，与临床肝脓肿的疾病特征吻合，整体证实肺炎克雷伯菌的种群特征、耐药/毒力分化与感染来源、所致疾病类型高度相关，沙门菌素在肝脓肿发生中的具体致病机制有待进一步探究。
图1、基于序列类型分布的肺炎克雷伯菌分离株最小生成树。每个圆圈代表一个序列类型（ST），圆圈内的颜色表示分离株来源。圆圈的大小表示分离株数量，两个圆圈之间的数字表示不同管家基因的数量。红色圆圈表示源自化脓性肝脓肿的分离株，紫色圆圈表示源自肺炎克雷伯菌的分离株，绿色圆圈表示源自携带者的分离株。
图2、基于核心基因组单核苷酸多态性（SNPs）的肺炎克雷伯菌分离株系统发育树。采用MEGA软件中的邻接法构建，共进行1000次布洛克重复。NTUH-K2044菌株作为参考，NCTC9735（大肠杆菌）作为外群。从携带者、化脓性肝脓肿及肺炎患者中采集的分离株分别以绿色、粉红色和紫色背景标注。各分离株旁的方框代表其耐药型（ST）。
图3、基于共同（5%至95%的检出率）附加基因的存在，采用PCA和PLS-DA分析。从携带者以及化脓性肝脓肿和肺炎患者中分离出的菌株分别以绿色、红色和紫色斑点表示。
图4、肺炎克雷伯菌分离株的耐药基因及质粒复制子分析。（A和B）不同来源分离株中每株的耐药基因数量（A）和ST分型（B）。（C和D）不同来源分离株中携带各抗生素耐药基因的分离株频率（C）和ST分型（D）。（E和F）不同来源分离株中每株的质粒复制子数量（E）和ST分型（F）。图4A、4B、4C、4E和4F中，绿色、红色和紫色圆点/栏表示分别来自携带者、化脓性肝脓肿患者和肺炎克雷伯菌患者的分离株。图4D中，ST23、ST29、ST367、ST375、ST412、ST65、ST700、ST86、ST11、ST15、ST383和ST45的分离株分别用蓝色、红色、绿色、紫色、橙色、黑色、棕色、深海蓝、深紫罗兰、深红、洛登色和黄色栏表示。
图5、肺炎克雷伯菌分离株的毒力分析。（A和B）不同来源（A）及不同耐药基因型（ST）的肺炎克雷伯菌分离株中毒力基因簇的频率。（C至F）来自不同来源的肺炎克雷伯菌分离株的生长曲线（C）、生物膜形成能力（D）、细胞毒性（E）和细胞黏附率（F）。（G）肝和肺中肺炎克雷伯菌分离株的细菌负荷。在图5A、5C、5D、5E、5F和5G中，绿色、红色、紫色和黑色斑点/柱状/线条分别表示来源于携带者的分离株、化脓性肝脓肿来源的分离株、肺炎克雷伯菌来源的分离株以及PBS培养基来源的分离株。在图5B中，毒力因子Yersiniabactin、Salmonchelin、Colibactin、Aerobactin、kfuABC、RmpA、Allantoin和LPS rfb位点分别以白色、红色、黄色、绿色、橙色、黑色、棕色和深蓝色柱状表示。
总结
肺炎克雷伯菌是院内感染和社区获得性感染的常见病原体，包括肺炎和化脓性肝脓肿，但关于该细菌种群结构的研究仍较为有限。本研究调查了来自携带者、化脓性肝脓肿患者和肺炎患者的肺炎克雷伯菌分离株的流行率及其分子特征，并通过基因组和表型分析确定各分离株之间的差异。共对232株肺炎克雷伯菌分离株进行了亚型分类，分为74个序列类型（ST）。不同来源的分离株具有各自不同的ST，其中肝脓肿患者中占主导的亚型为ST23，肺炎患者中则以ST11为主。全基因组分析还区分出三个与分离株来源一致的系统发育群。从肝脓肿患者采集的分离株携带显著更多的毒力因子，而从肺炎患者采集的分离株则携带显著更多的耐药基因和复制元件。
几乎所有肝脓肿分离株的ST（93/97 [95.88%]）均与毒力因子salmochelin高度相关，而大多数肺炎分离株的ST（52/53 [98.11%]）肺炎病原体与萨尔莫链霉菌无相关性。从肝脓肿中分离出的菌株在细胞毒性及小鼠模型中表现出更高的致病性。这些数据为以下假设提供了基因组学支持，来自携带者、肝脓肿患者和肺炎患者的分离菌株具有不同的基因组特征。不同来源的菌株在很大程度上不重叠，表明不同患者可能通过不同的途径感染。未来还需进一步研究萨尔莫链霉菌及其他致病因子的致病机制。Bioscreen C全自动生长曲线分析仪用于动态监测肺炎克雷伯菌的生长动力学以评估基础增殖能力差异。